光氧化反应增加去细胞牛颈静脉的组织稳定性

目的:观察去细胞及去细胞后光氧化反应对牛颈静脉的组织稳定性的影响。方法:实验于2005-06/09在中南大学湘雅二医院胸心外科实验室完成。①将新鲜牛颈静脉纵形剪开成血管片,横行切取牛颈静脉血管片成6根血管条,随机分为6组,新鲜组,去细胞组,及根据不同的光氧化处理时间将去细胞结合光氧化处理组分为去细胞后光氧化反应12,24,36和48h组。②通过测定处理前后的组织厚度、热皱缩温度、抗张强度及组织蛋白提取分析来比较组织稳定性。结果:①各组在处理前后的厚度:去细胞处理后血管片比处理前变薄[(0.36±0.85),(0.43±0.94)mm,P<0.05],而去细胞再光氧化处理后的血管片厚度无明显改变(P>0.05)。②各组血管片组织稳定性评价:去细胞组热皱缩温度及抗张强度比新鲜组、去细胞后光氧化反应12h组、24h组、36h组、48h组明显降低[热皱缩温度:(69.75±0.54),(72.50±0.53),(73.80±0.59),(74.40±0.46),(75.10±0.21),(75.20±0.26)℃,P<0.05;抗张强度:(3.13±0.94),(5.19±0.65),(4.54±0.88),(4.67±0.60),(5.55±0.43),(5.80±0.82)MPa,P<0.05];经光氧化处理后热皱缩温度上升且高于新鲜组(P<0.05);而最大应力与新鲜组比较无明显变化(P>0.05);去细胞后光氧化反应组的组织蛋白提取量明显少于新鲜组及去细胞组,且随光氧化反应时间延长,组织蛋白提取量逐步减少。结论:去细胞处理降低了牛颈静脉的组织稳定性,而经光氧化进一步处理后组织稳定性增强,且随光氧化时间延长组织稳定性增强。     

去细胞光氧化牛颈静脉血管片内膜光化学接枝CD34抗体的制备及初步评价

目的:用光交联剂SANPAH将不同浓度鼠抗人CD34抗体接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉表面,明确接枝鼠抗人CD34抗体的最佳反应摩尔比和最佳浓度.方法:实验于2006-06/08在中南大学湘雅二医院生物材料实验室完成.按4个不同摩尔比(1:0,1:10,1:20,1:50),SANPAH和4个不同浓度[0.665 μmol/L(100 mg/L),1.33 μmol/L (200 mg/L),6.65 μmol/L (1 g/L),13.3 μmol/L (2 g/L)]鼠抗人CD34抗体进行反应后,经紫外线照射光化学接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉上,各组进行快速冰冻切片,滴加FITC标记的羊抗鼠IgG,然后在荧光显微镜下观察不同摩尔比和浓度反应结合的荧光效果,从而初步推断出最佳的反应和结合的摩尔比和浓度.结果:随着鼠抗人CD34抗体的浓度的升高,荧光整体上是越来越强,但是当浓度高于6.65 μmol/L时,荧光差别不是很明显;当二者的反应摩尔比为1:20时,荧光最强.结论:最佳的鼠抗人CD34抗体和SANPAH反映接枝的浓度是6.65 μmol/L,最佳的摩尔比是1:20.     

新型抗钙化牛颈静脉管道材料的体外细胞毒性评价

背景:TritonX-100、环氧氯丙烷联合改性处理戊二醛固定的牛颈静脉管道是一种新型抗钙化右心管道材料,其生物相容性方面的研究较少。目的:评价新型抗钙化牛颈静脉管道的体外细胞毒性。方法:通过CCK-8法检测新型抗钙化牛颈静脉管道(实验组)及单纯戊二醛处理牛颈静脉管道材料浸提液(对照组)对L-929小鼠成纤维细胞的毒性作用,以第2,4天为检测时间点,计算细胞相对增殖率、对材料毒性进行分级。结果与结论:CCK-8法细胞毒性试验显示新型抗钙化牛颈静脉管道材料浸提液第2,4天L-929细胞增殖率均在85%以上,毒性分级为1级,无细胞毒性,且显著优于对照组(P<0.05)。提示经戊二醛、TritonX-100、环氧氯丙烷联合处理制备的新型抗钙化牛颈静脉管道材料无细胞毒性。     

辛醇/乙醇混合液处理的牛颈静脉的遗传毒理学评价

【目的】对辛醇／乙醇混合液处理的牛颈静脉的遗传毒性进行评价。【方法】采用微核试验、染色体畸变试验及AMES试验进行遗传毒性评价。【结果】试验组股骨骨髓细胞微核率及染色体畸变率与阴性对照组之间X^2检验差异无显著性（P〉0．05）;与阳性对照环磷酰胺组差异有显著性（P〈0．05）;AMES试验中试验组菌落数均未超过阴性对照组菌落数的2倍．试验结果为阴性。【结论】辛醇／乙醇混合液处理的牛颈静脉无明显遗传毒性作用。     

去细胞坐骨神经天然支架的成分分析

背景：目前周围神经去细胞的方法较多,应用较多的是化学萃取法和液氮冻融法,但是化学萃取法耗时较长,而液氮冻融法则去除细胞不彻底。作者在查阅大量文献和多次实践的基础上,最终确定了冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法对坐骨神经进行脱细胞处理。目的：对优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架进行形态学分析,并对其成分进行鉴定。方法：取Wistar大鼠双侧坐骨神经,随机分为2组,对照组不做特殊处理,实验组用冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法进行脱细胞处理。结果与结论：用优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架呈三维管状立体结构,许旺细胞、髓鞘及轴突去除完全。经免疫组化鉴定,Ⅰ型、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白等细胞外基质主要成分得到保留。     

聚乙二醇交联去细胞瓣构建组织工程瓣膜复合支架

目的 采用分子量20 kDa 的枝化状丙烯酰化聚乙二醇(PEG)交联巯基化去细胞瓣,构建组织工程瓣膜复合支架,并对支架的结构稳定性、力学性能和细胞相容性进行初步检测.方法 取猪新鲜主动脉瓣叶,进行脱细胞瓣处理,制备去细胞瓣并巯基化.戊二醛固定去细胞瓣,PEG 交联巯基化去细胞瓣.形态学观察去细胞及交联效果,差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度,Ⅰ型胶原酶溶液测定其抗酶性分解能力,拉伸实验测定其抗拉强度和弹性模量,并采用AlamarBlue 法测定支架对MRC-5 人胚肺细胞的细胞毒性.结果 HE 染色和扫描电镜(SEM)显示去细胞完全,细胞外基质保存完整;PEG 交联后瓣叶变薄,纤维增粗呈束.PEG 交联瓣的热收缩温度为(75.16 ±0.69)℃,与去细胞瓣[(67.63 ±1.09)℃]相比有显著提高,其差异有统计学意义(P ＜0.05).PEG 交联瓣6 h 及12 h酶性分解率分别为(17.52 ±1.69)%和(48.83 ±2.67)%,与去细胞瓣[(64.91 ±2.05)%和(98.23 ±1.20)%]相比,分解率显著下降.PEG 交联瓣抗拉强度较去细胞瓣显著为高,并达到天然瓣水平,弹性模量则远高于其他各组.细胞毒性试验显示PEG 组和对照组活力细胞差别为(1.82 ±0.03)%,无统计学意义(P ＞0.05).结论 PEG 交联可显著改善去细胞瓣结构稳定性和力学性能,而无明显细胞毒性,有望用于组织工程瓣膜复合支架的构建.     

去细胞同种异体神经支架种植许旺细胞的体外培养

背景:前期的研究中分别探讨了使用复合酶消化法及差速贴壁法对许旺细胞培养的影响以及聚氧乙烯辛烷基酚(TritonX.100)制备同种异体神经支架.目的:通过化学萃取法制备同种异体神经支架,并将培养的许旺细胞与支架进行体外结合培养.方法:取Wistar大鼠双侧坐骨神经,运用30 g/L三硝基甲苯和40 g/L脱氧胆酸钠分别萃取1,2和3次,在萃取神经和未萃取神经的中段取材,行苏木精一伊红染色,S-100及Laminin免疫组织化学染色及透射电镜检测.取SD胎鼠坐骨神经及臂从神经,使用复合酶消化,差速贴壁及Arab.c抑制成纤维细胞生长的培养方法获得大量高纯度的许旺细胞.再把许旺细胞注入同种异体神经支架内,并行透射电镜及扫描电镜观察.结果与结论:用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后,坐骨神经内细胞和髓鞘被清除,神经基底膜被保留.电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成.萃取次数增加后,神经内残留的S-100蛋白显著减少,但反复萃取后支架结构受破坏.去细胞同种异体神经支架适合许旺细胞体外生长,并有迁移排成行的特性.结果提示,用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除细胞而保留神经基底膜管,是制备具有仿生结构神经支架的理想方法.神经支架种植许旺细胞后可能成为一种理想的神经缺损修复材料.     

比较猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用

目的：研究猪、熊胆粉的主要成分猪去氧胆酸及牛磺熊去氧胆对神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的保护作用。方法：实验于2000-07／2002-08在北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室完成。培养人神经母细胞瘤细胞，以含连二亚硫酸钠的无糖Earle液模拟造成缺氧缺糖再给氧损伤，随机分为正常培养对照组，缺氧缺糖再给氧组，猪去氧胆酸3.125，1．563，0.781μmol／L浓度组，牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组。应用锥虫蓝染色测定细胞死亡率，应用比色法测定乳酸脱氢酶漏出率，四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞存活率，应用以Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜检测细胞坏死率和凋亡率。结果：①细胞死亡率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1563．0．781μmol／L浓度组细胞死亡率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(34．1&;#177;7.1)％，(32.8&;#177;8．2)％，(29.4&;#177;9．8)％，(27.7&;#177;6.9)％，(26.8&;#177;9．4)％，(26.2&;#177;11.1)％，(71.2&;#177;9.2)％，P&;lt;0.001]。②乳酸脱氢酶漏出率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组乳酸脱氢酶漏出率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(46．6&;#177;5.6)％，(49.8&;#177;5.3)％，(47．0&;#177;4.0)％，(48.5&;#177;2.7)％，(44.1&;#177;4.3)％，(40．2&;#177;7.5)％，(66.4&;#177;7．6)％，P&;lt;0.001)。③细胞存活率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0.781μmol／L浓度组细胞存活率均明显高于缺氧缺糖再给氧组[(44.5&;#177;3.2)％，(45.3&;#177;2．0)％，(41.5&;#177;1．6)％，(41．6&;#177;2.4)％，(37.6&;#177;2．8)％，(40．1&;#177;18)％，(25.6&;#177;3．7)％，P(0.01～0.051。④细胞坏死率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0．781μmol／L浓度组细胞坏死率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(19.7&;#177;6.2)％，(23.9&;#177;7.0)％，(26.0&;#177;6.9)％，(21.8&;#177;5．6)％，(18.7&;#177;6.1)％，(25.4&;#177;5．8)％，(46.8&;#177;10.4)％，P&;lt;0.01]。⑤细胞凋亡率：猪去氧胆酸3．125，1．563μmol／L浓度组和牛磺熊去氧胆3．125，1.563，0.781μmol／L浓度组明显低于缺氧缺糖再给氧组[(7.4&;#177;2.7)％，(8.3&;#177;4.0)％，(6.9&;#177;3.8)％，(9.2&;#177;4.5)％，(8．7&;#177;3.6)％,(16．0&;#177;4.8)％，P&;lt;0．05]。结论：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均可明显地降低神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤时的细胞坏死率、凋亡率，显著提高细胞存活率，显著减少乳酸脱氢酶的漏出，表明猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均具有显著的抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用，并且猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸之间没有显著差异。     

去细胞化全肝生物支架循环灌注培养条件下体外细胞再植

背景:通过去细胞化技术制备全肝生物支架成为缓解供体短缺的新技术,优化肝脏组织的去细胞化流程成为新的课题。目的:通过去细胞化技术建立完整保留肝脏三维结构和脉管系统的全肝生物支架,利用自主设计的循环灌注培养装置实现生物支架体外细胞再植。方法:通过门静脉路径循环灌注去垢剂TritonX-100,十二烷基硫酸钠,并用磷酸盐缓冲液洗脱残留去垢剂。通过动态循环灌注培养装置进行支架与HepG2细胞的共培养,观察植入细胞在全肝生物支架内的功能表达。结果与结论:经去垢剂灌注后,支架呈现保持肝脏三维结构的透明结构,苏木精-伊红染色以及扫描电镜结果显示细胞成分被完全移除,Masson’sTrichrome染色可见大量胶原纤维,免疫组化结果证实纤维连接蛋白和层粘连蛋白保存完整。循环灌注培养下细胞白蛋白表达量及尿素合成量较平板培养明显提高。说明去细胞化肝脏生物支架可作为体外肝脏组织重建的基础材料,动态循环灌注方法可实现支架中细胞再植。     

亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包的细胞毒性

背景：实验室前期工作中采用牛心包材料，经去细胞处理，降低其免疫原形，进而进行染料介导的光氧化处理，得到了生物力学特性稳定、优良的生物瓣膜构建材料。目的：拟参照材料生物学评价标准评价亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包的细胞毒性。设计、时间及地点：以细胞为对象的观察对照实验，于2007-07／2008—03在解放军第四军医大学西京医院心脏外科实验室完成。材料：L929细胞株由解放军第四军医大学口腔生物学教研室提供。方法：①间接接触细胞毒性试验：L929细胞经亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包浸提液培养后，采用四甲基偶氮唑盐比色法测定其相对增殖率。根据国内医疗器械生物学评价标准评定材料毒性程度。②直接接触细胞毒性试验：将L929细胞与亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包直接接触培养，于培养不同时间点观察细胞生长状态。③将L929细胞种植于亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包表面，应用扫描电镜观察其生长情况。主要观察指标：①间接及直接接触细胞毒性试验结果。②扫描电镜观察结果。结果：①亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包性质稳定，细胞毒性程度为0-1级。②L929细胞与心包材料直接接触培养生长良好，形态学无明显改变。结论：染料亚甲蓝介导光氧化处理去细胞牛心包细胞相容性好。     

Differential distribution of tolerogenic bovine gamma-globulin in lymphoid tissues

Deaggregated, tolerogenic bovine gamma-globulin was traced after intravenous injection into DDD mice. Amount of organ-distributed tolerogen varied among lymphoid organs such as spleen, thymus, axillary lymph node and femur bone marrow, probably depending on the amount of blood supply. On the other hand, the tolerogen elimination rate (TER) in these organs was almost the same as TER in blood, the half life being 2.6 days. Although the TER of tissue-associated tolerogen and of cell-associated tolerogen were also almost the same as that in blood, relative amount of cell-associated tolerogen differed among organs, the antigen amounts being 77 times higher in lymph node cells and 4 times higher in spleen and bone marrow cells than in thymus cells. These results are discussed in relation to the difference in the tolerance inducibility among lymphoid organs reported previously.     

New sensitive bioassay for sulbactam in bovine tissues.

A quantitative cylinder plate bioassay for sulbactam has been developed which can detect concentrations as low as 0.01 microgram/g in bovine muscle, fat, kidney, and liver tissues. This procedure may also be applicable to human tissues and fluids. In addition to the improved sensitivity, this method differs from all previously described systems because it is based on inhibition by sulbactam of a cell-free beta-lactamase incorporated in the assay agar. The assay is unaffected by the presence of ampicillin even at concentrations 10 times that of the sulbactam concentration. This report describes the analytical technique as well as the accuracy and precision of the method. The assay can be applied to tissue depletion studies.     

Flow volume in the jugular vein and related hemodynamics in the branches of the jugular vein

Venous reflux in the internal jugular vein branches (JB) was found frequently in patients of certain neurologic disorders. We hypothesized that the retrograde-flow in JB is associated with retrograde hypertension transmitted from the internal jugular vein (IJV), which presumably underlies those neurologic disorders. In this study, we used color-Doppler imaging to evaluate the dynamic venous flow patterns in the IJV and its branches in 50 normal individuals (21 men, 29 women; mean age: 40.9 +/- 14.9 y, range: 22 to 70 y). The flow-direction of all detected JB (n = 100) was flowing into the IJV at baseline. During the Valsalva maneuver (VM), 38 JB (38%) had a retrograde-flow. Retrograde-flow in JB was significantly associated with IJV valve incompetence (OR = 7.6; 95% CI = 2.6 to 21.8; p = 0.0002) and greater IJV blood flow volume (blood flow volume >670 mL/min) (OR = 6.6; 95% CI = 1.8 to 24.5; p = 0.0052), both of which may reflect higher IJV pressure transmission during VM. The sonographic findings can be used in the future studies of diseases that are suspected to be related with retrograde cerebral venous hypertension due to an elevated IJV venous pressure.     

颈内静脉的影像学调查及颈总动脉旁颈内静脉穿刺法的研究

目的　探讨颈内静脉穿刺的最佳部位和方法。方法　随机抽取 31例无劲、胸疾患的成年患者颈部核磁共振图像和 2 0位青年志愿者颈部超声图像 ,取甲状软骨上缘、环状软骨、第七颈椎三个横截面的图像 ,分别观察和测定动、静脉的前后关系、动、静脉的内外关系、静脉到皮肌的距离。对 1 2 4例需要行中心静脉置管的患者采用颈总动脉旁颈内静脉穿刺法穿刺。结果　颈总动脉与颈内静脉紧密相连 ;颈内静脉有从上到下依次在动脉的后面过渡到平行、前面的趋势 (P <0 0 1 ) ;三个平面自上而下颈内静脉前壁与颈前皮肤的距离依次变短 (P <0 0 1 )。本组 1 2 4例患者穿刺成功 1 2 3例 ,成功率 99% ,无任何并发症。结论　环状软骨平面颈总动脉外侧 0 5cm处为颈内静脉穿刺的最佳进针点 ;颈总动脉旁颈内静脉穿刺法具有定位明确、操作安全、方便等优点     

植入负度数后房型人工晶状体对眼内组织稳定性的影响

背景:白内障合并超高度近视眼的患者手术摘除白内障后,多数学者丰张植入人工晶状体.目的:观察超声乳化白内障吸出联合负度数人工晶状植入治疗超高度近视合并白内障的效果.设计、时间及地点:回顾性分析,于2006-10/2007-10在潍坊医学院附属医院眼科中心完成.对象:选取本院同期收治的行超声乳化白内障吸除负度数人工晶状体植入术患者28例(50只眼),均为超高度近视眼合并白内障,术前矫正视力<0.1共45只眼,0.1～0.15共5只眼.Sensar AR40e疏水性丙烯酸酯折叠式人工晶状体为AMO公司产品.方法:术前常规检查眼轴长度、测量角膜曲率,以第3代理论公式(Sanders-Retzlaff-Kraff T,SRK-T)计算人工晶状体屈光度数,实际植入人工晶状体的屈光度数为测量度数增加 1.00～ 3.50 D.眼表面麻醉,11～12点钟方位角膜缘后1.0 mm处做宽3.0 mm的角巩膜隧道切口,直径5.0 mm连续环形撕囊,使用超声乳化仪吸除晶状体核,囊袋内植入屈光度数为-1.00～-10.00 D人工品状体.术后随访3～12个月.主要观察指标:术后最佳矫正视力、屈光度数偏差值及并发症.结果:术前平均眼轴长度为(32.19±2.31) mm.术后最佳矫正视力≥0.2共43只眼(86.0%),≥0.5共23只眼(46.0%);屈光度数偏差值<±1.00 D共25只眼(50.0%),<±2.00 D共44只眼(88.0%).术中仅1只眼晶状体后囊膜破裂.随访3个月时,1眼品状体后囊轻度浑浊,术眼无视网膜和脉络膜脱离.随访12个月时,5眼晶状体后囊轻度浑浊,术眼无视网膜和脉络膜脱离.结论:超声乳化自内障吸除后植入负度数后房型人工晶状体既可以增加眼内组织的稳定性,防止发生视网膜脱离,又可同时进行屈光矫正.     

32例超声引导下颈内静脉穿刺置管术体会

目的评估超声引导下颈内静脉穿刺的临床价值。方法通过二维超声显像,明确右侧颈内静脉的解剖位置,在超声引导下对32例尿毒症患者进行颈内静脉穿刺置管。结果28例1次成功,1例进针3次穿刺成功,2例穿刺失败,1例因颈内静脉血栓不能穿刺,穿刺成功率93.5%,无1例出现误穿颈动脉和气胸等穿刺并发症。结论超声引导下颈内静脉穿刺置管术是一种快速简便、安全有效的方法。