原位杂交法检测不同发育阶段小鼠睾丸中TERT mRNA的表达

本实验应用原位杂交方法检测出生后 10d～ 90d雄性小鼠睾丸中TERTmRNA表达及定位。原位杂交方法 (Insituhybridization)结果显示 :① 10d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮中尚无TERTmRNA阳性表达 ;② 2 0d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮可见TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞 ;③ 30d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮也可见TERTmRNA阳性表达 ,初级精母细胞表现强阳性表达 ;④ 6 0d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮可见明显TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞及精子细胞 ;⑤ 90d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮有较强烈的TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞。此结果提示我们 :端粒酶在精子发生过程中存在动态变化 ,端粒酶的表达与精子发生存在密切关系。     

p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达

目的：探讨p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达．方法：应用免疫组织化学SABC法检测1～7周龄小鼠睾丸p38MAPK的表达和定位．结果：在2周龄小鼠睾丸生精小管上皮中即可观察到p38MAPK免疫阳性反应，免疫反应阳性细胞为精原细胞；3，4和5周龄小鼠睾丸仅有个别生精小管上皮可见p38 MAPK免疫阳性反应；6，7周龄小鼠睾丸中p38 MAPK表达较丰富，免疫反应阳性细胞为精原细胞和初级精母细胞，免疫阳性反应物均主要位于细胞核内．在7周龄小鼠睾丸中还可见到部分间质细胞呈p38 MAPK阳性，免疫阳性反应物主要位于细胞质内．结论：p38 MAPK可能对生精细胞的增殖分化以及雄激素的分泌具有调控作用。     

雌性小鼠颌下腺 NGF mRNA 的原位杂交检测

应用地高辛标记的人β神经生长因子ＤＮＡ探针原位杂交组化技术，研究雌性ＩＣＲ小鼠颌下腺的神经生长因子（ＮＧＦ）基因表达。颌下腺经４％多聚甲醛固定，常规冰冻切片，并以同种雄性小鼠颌下腺作阳性对照。实验结果显示，雌性小鼠颌下腺的ＮＧＦｍＲＮＡ分布与雄性小鼠相同，主要存在于纹状管和颗粒曲管上皮细胞中，但杂交信号明显弱于雄性小鼠；在原位杂交反应阳性的纹状管或颗粒曲管上皮细胞之间常可见到几个阴性细胞，阳性管道的密度亦显著低于雄性小鼠。研究表明，小鼠颌下腺ＮＧＦ基因的表达受到雄激素的调节，这种调节作用可能发生于转录水平。ＮＧＦ基因转录少，纹状管或颗粒曲管部分上皮细胞ＮＧＦ基因不开放以及颗粒曲管不发达是雌性小鼠颌下腺ＮＧＦ含量明显低于雄性小鼠的主要原因。     

周期素cyclin G1在小鼠睾丸生精上皮中的表达特点

目的 观察细胞周期素cyclin G1在不同年龄小鼠睾丸生精上皮中的表达与分布,初步探讨其在精子发生过程中的生理意义.方法 分别选用3周龄、7～8周龄及11～12月龄的雄性昆明小鼠,运用免疫组化方法观察分析cyclin G1在睾丸生精上皮中的表达.结果 cyclin G1在3周龄小鼠睾丸生精上皮中无明显表达;在7～8周...     

Ddx3基因在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达

目的:观察小鼠睾丸初次生精过程中的发育特点;检测Ddx3基因与蛋白在小鼠睾丸生精过程中的表达模式;探讨Ddx3基因对小鼠睾丸生精的影响。方法:采用HE染色与PAS染色的方法观察不同日龄小鼠睾丸组织的石蜡切片;用荧光实时定量PCR的方法检测Ddx3 mRNA在小鼠睾丸精子发生过程中的表达;采用免疫组织化学和Western blot方法检测DDX3蛋白在小鼠睾丸初次生精过程中的表达特点和细胞内定位。结果:HE染色结果显示4、13、21、35、42和60日龄是小鼠睾丸发生初次生精过程的特定阶段;荧光实时定量PCR结果显示Ddx3 mRNA在4日龄以后小鼠睾丸组织中均有表达,于35日龄开始明显增高,随后表达水平保持稳定;Western blot显示DDX3蛋白在35、42和60日龄小鼠睾丸生精小管中出现特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示DDX3蛋白主要在初级精母细胞和精子细胞的细胞质和细胞核中表达。结论:DDX3蛋白在小鼠初次精子发生过程中呈现特异性表达,提示Ddx3基因可能在精母细胞与精子细胞的发育中发挥作用。     

小鼠生后不同发育阶段睾丸生殖细胞的超微结构研究

目的:研究生精细胞、支持细胞、睾丸间质细胞在生后不同发育阶段的超微结构特点,了解雄性生殖细胞发育、分化和成熟的过程,亲代细胞与子代细胞间及3种生殖细胞在发育过程中的相互影响关系.方法:分别取生后5天、10天、20天雄性小鼠睾丸,固定后作超薄切片,染色后透射电镜下观察并拍片记录.结果:生精小管的细胞组合在不同发育阶段表现不同.生后5天,小管管腔很小,管壁细胞排列呈单层,细胞类型仅有精原细胞和幼稚的支持细胞两种,且均于基膜相贴,睾丸间质细胞不可见.生后10天,小管管腔增大,细胞排列呈2～3层,精原细胞增殖分化,支持细胞、睾丸间质开始发育.生后20天,细胞层数增多,出现各级生精细胞,增殖的子代细胞分布于近腔面,可见胞质间桥和变态发育中的精子;支持细胞、间质细胞发育成熟.结论:生精细胞在生精小管中的分布具有规律性,不同发育阶段表现出不同的细胞组合.在发育过程中,间质细胞、支持细胞的结构和功能的成熟先于生精细胞的分化,表明生精细胞的发育分化受间质细胞、支持细胞及基膜的共同参与下完成的.     

原位杂交法检测胃癌组织中IL-6及其受体mRNA的表达

胃癌是最常见的癌肿之一,应用原位杂交技术检测胃癌组织中IL—6及其受体mRNA的表达情况,具有灵敏度高、特异性强的特点,而且较直观地在组织原位和转录水平对标本中IL—6及其受体进行研究,这使得形态学观察与功能学检测相结合,更能反映胃粘膜不同病变细胞分泌IL—6及其受体的情况。     

原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子mRNA的表达

目的　观察视网膜色素上皮细胞 ( RPE)在炎性介质刺激下炎前因子 m RNA的表达 .方法　培养的人 RPE经IL - 1β ( 10μg· L- 1 )和脂多糖 ( 1m g· L- 1 )的刺激后 ,用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交 ,检测 RPE炎前因子IL - 1β,IL - 6,IL - 8和 TNF-α m RNA表达 .杂交结果使用图像分析法进行比较 .结果　原位杂交显示 RPE细胞质中均呈现浓淡不一的淡蓝色着色 ,胞核不着色 .其中 IL - 6m RNA在脂多糖刺激下染色较浅 ,增加脂多糖的剂量不能提高其表达 .图像分析显示在 IL - 1β ( 10μg· L- 1 )和脂多糖 ( 1m g· L- 1 )刺激下 ,RPE表达 IL - 6m RNA的吸光度分别为 10 8± 18和3 5± 14 ,二者之间有显著性差异 ( P<0 .0 1) .结论　在 IL - 1β和脂多糖刺激下 ,人 RPE可以表达炎前因子 IL - 1β,IL - 6,IL - 8和 TNF-α的 m RNA .     

地高辛标记的寡核苷酸探针两步原位杂交检测胸液细胞hTERT mRNA

目的 建立原位杂交法检测胸液细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的实验方法，初步评价该法识别胸液中肿瘤细胞的效果。方法 取23例胸腔积液病例标本，以地高辛标记的寡核苷酸探针对胸液细胞hTERT mRNA行两步原位杂交，再通过抗原-抗体-酶-显色途径，测出hTERT mRNA信号。实验研究设严格的阴性、阳性对照，且与临床诊疗各自独立进行。结果 本法对9例恶性胸腔积液病例检测的结果均为阳性，即无论细胞形态是否异常，镜下均可见到有细胞质深染及部分细胞核少许点状着色的细胞。此9例中，7例经胸液细胞形态学检查亦示阳性者．可同时观察到形态明显异常的肿瘤细胞，其余2例经反复胸液细胞形态学检查阴性，但胸膜活检确诊为恶性胸腔积液者，虽未见到形态明显异常细胞，但镜下可发现胞质深染、部分细胞核少许着色的细胞。14例良性胸腔积液病例的检测结果均为阴性。结论 原位杂交法检测胸液细胞hTERT mRNA可望作为一种临床细胞病理学的新方法，用以鉴别胸腔积液的良、恶性，同时判定肿瘤细胞的类型。     

成骨肉瘤组织中stathmin基因的表达意义

目的 明确stathmin基因在人成骨肉瘤组织有高表达并对其进行组织学定位。方法 用地高辛标记全长stathmin基因，原位杂交方法检测stathmin基因在45例人成骨肉瘤组织及10例正常组织中的表达情况。结果 在45例成骨肉瘤组织中有24例stathmin基因呈阳性表达（阳性率53％），阳性颗粒可见于胞质及胞核；10例正常组织中2例呈弱阳性表达，差异显著（P＜0．05）。结论 stathmin基因在骨肉瘤中的高表达与骨肉瘤的发生，发展有重要的相关性，该基因有望成为人成骨肉瘤生物治疗中的重要靶基因。     

ADAM19 在小鼠睾丸发育中的时空表达

目的 阐明含有去整合素和金属蛋白酶结构域的跨膜蛋白19(ADAM19)在小鼠睾丸发育中的作用.方法 采用半定量RT-PCR和免疫组化两种实验方法,分别检测ADAM19 mRNA和蛋白质在小鼠睾丸发育中的时空表达.结果 ①最早在胚胎发育的15.5 d才能检测到ADAM19 mRNA的表达,后其表达随着胚胎发育天数的增加而逐渐升高,到围产期表达水平达到最高.出生后,ADAM19 mRNA的表达呈现显著下降的趋势,到成体睾丸中就几乎检测不到ADAM19的表达.②和其mRNA表达变化趋势一样,ADAM19蛋白也是首次在胚胎发育的15.5 d被检测到,一直持续存在到出生后一周,一周后则几乎检测不到;阳性表达信号主要定位在睾丸的曲细精管(睾索)中.结论 ADAM19 在小鼠睾丸中的表达具有显著的发育依赖性.     

Studies on Expression of P1 Protamine Gene in Rat and Mouse Testis

Protamine is a kind small,basic protein rich in arginine residues and found to be complexed with DNA in spermatozoa. We have cloned a 150 bp cDNA encoding the rat protamine (rP) by RT-PCR technique.Dig-labelled cDNA for rP was used for Northern blot analysis to study the expression of P1 protamine gene in rat and mouse.P1 protamine mRNA was detected only in rat testis,no hybridization signals were de-tected in rat brain and lever.In addition,the presence of P1 protamine mRNA was detected not only in rat testis,but also in mouse testis.Dig-labelled cDNA for mouse protamine 1 (mP1) was used to study the expression of mP1 gene during the process of sexual maturation of mouse.7-8 d after birth,no mP1 mRNA could be detected.At d 24-26,mP1 mRNA was detectable migrating as a homogeneous band at 580 nu-cleotides,whereas in sexually mature animals,a heterogeneous mixture of RNAs ranging from 450-580 bases in length was observed.Histological studies revealed that in the testis of 7-8-day-old mouse, spermatogenesis has developed to the sperma-tocyte stage, whereas round spermatids (Rs) were present in the testis of the mice with 24-26 d age and elongating spermatids(Es)were present in the testis of sexually mature animals. Electrophoresis of total nuclear basic proteins(TNBP)revealed that the Rs could possess the somatic histones,while Es was found to have protamine and less histone.These results indicate that the P1 protamine gene is tissues-specifically ex-pressed and the P1 protamine is showing to be conservative in evolution.During the process of sexual maturation,along with morphological changes,mP1 gene was tran-scribed in Rs and translated in Es.The mechanism of protamine gene expression was discussed.     

食管癌发生发展过程中c-myc基因表达的原位杂交研究

目的 :探讨食管癌发生发展过程中c myc基因表达的变化。方法 :用原位杂交方法 ,研究 2 1例食管鳞癌和相应癌旁粘膜中c myc基因的表达。结果 :食管正常粘膜、单纯增生、不典型增生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级和原位癌的杂交阳性率分别为 12 5 % ,4 4 4 % ,5 2 9% ,5 3 8% ,5 8 3 %和 61 1% ,鳞癌Ⅰ、Ⅱ级分别为 5 0 0 %和 4 0 0 % ,其中单纯增生、不典型增生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级、原位癌和鳞癌Ⅱ级的杂交阳性率较正常粘膜差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;正常粘膜阳性杂交信号低于单纯增生至原位癌各病理组织类型 ,癌组织的杂交信号多明显高于相应癌旁粘膜。结论 :c myc基因在食管癌发生发展过程中的单纯增生阶段激活 ,c myc基因的高度表达可能作为食管癌变的原因之一而非癌变的结果     

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

目的构建并筛选小鼠睾九组织特异基因Fank1干扰载体，为进一步研究Fank1基因功能及与Fank1基因相关男性不育的基因治疗奠定基础。方法根据Fank1基因cDNA序列，利用http：//www．dharmacon．com/在线设计软件设计2条干扰序列，分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中，同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列，构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED—Fank1。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞，并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况，分别采用RT—PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。结果经PCR检测鉴定，含干扰序列的重组质粒pSuper-shFank1 631#,pSuper-shFank 1247#及pdsRED—Fank1表达载体构建成功，测序分析完全正确。转染293T细胞36h后，荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达，抑制效率分别为95％和90％，RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制（P〈0．05）。结论成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体，为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。     

胃癌组织中PTEN基因和蛋白表达的研究

目的　探讨在胃癌组织中 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 基因和蛋白的表达情况及临床病理意义。方法　应用免疫组织化学和原位杂交技术检测５０ 例胃癌及其癌旁组织中 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 蛋白及 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达情况,同时结合病人的临床病理资料进行分析。结果　５０ 胃癌组织中, Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 蛋白阳性表达率４８ ％ ,阳性率５２ ％ ,阳性反应分布在胞浆中。５０ 例胃癌组织中 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 阳性表达率６０ ％ ,阳性率４０ ％ ,阳性信号显示于胞浆中。 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 蛋白及 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 在胃癌组织中的阳性表达与患者性别,年龄无明显相关性,但均与组织分化程度明显相关,高分化腺癌组的阳性率分别为７７ ．８ ％ 及８８ ．９ ％ ,低分化腺癌组的阳性率分别为３１ ．３ ％ 及４３ ．８ ％ 。结论　胃癌组织中存在较高比例的 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎｍ Ｒ Ｎ Ａ 及 Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 蛋白阳性表达,说明在胃癌的发生发展中, Ｐ Ｔ Ｅ Ｎ 基因失活起着重要作用,两者的阳性表达均有一定的预后意义。     

优化整体原位杂交方法检测基因在幼鼠大脑中的表达

目的 优化整体原位杂交方法,用于检测基因在幼鼠大脑中的时空表达分布。方法 通过摸索最佳蛋白酶K的消化时间,改良杂交缓冲液成分,并延长杂交时间和漂洗时间,对整体原位杂交方法进行优化,并用优化的方法检测了Cdh6、Bhlhb5和Lmo4mRNA在出生后7天的小鼠大脑中的整体表达分布。结果 采用优化的整体原位杂交方法成功地检测了3种mRNA在幼鼠全脑的区域性表达特征,特异性杂交信号强,非特异性背景低。结论 成功优化了幼鼠全脑原位杂交方法,为开展后续的研究打下基础。     

骨桥蛋白在雄性小鼠生殖系统中的表达及意义

目的:检测骨桥蛋白(OPN)在小鼠睾丸、附睾、精子中的表达,探讨其意义。方法:用免疫组织化学方法检测OPN在正常小鼠睾丸及附睾中的表达情况,免疫细胞荧光法检测OPN在小鼠精子中的表达情况,分析OPN与雄性小鼠生殖能力的关系。结果:OPN在小鼠睾丸、附睾组织及精子上均具有特征性表达。在睾丸中,OPN表达于Sertoli细胞、Leydig细胞以及各级生精细胞,尤其是精原细胞、精子细胞和精子的胞质中;附睾内,OPN的表达主要见于各段上皮主细胞胞质中,部分基细胞、亮细胞中也可见到免疫阳性反应。并且附睾头部的免疫阳性染色相对较弱;免疫荧光染色则将OPN定位于附睾尾精子的顶体帽区及鞭毛。结论:小鼠睾丸、附睾及精子中均存在OPN的特异性表达,OPN可能参与精子的发生及成熟过程,并与精子的活力和受精能力密切相关。