热损伤角质形成细胞培养上清对真皮成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1表达的影响

目的探讨角质形成细胞(keratinocytes,KC)热损伤后对真皮成纤维细胞(fibroblasts,Fb)Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)表达的影响。方法分离培养人正常Fb及KC,分别建立KC、Fb热损伤模型;收集正常及热损伤12 h后细胞培养上清,并配制成浓度为50%的细胞条件培养液。根据培养液不同将第3～5代Fb分为3组,分别采用含50%热损伤KC培养上清(A组)、含50%正常KC培养上清(B组)的条件培养液及单纯DMEM(C组)培养,24 h后收集3组细胞;另于培养0、1、2、6、12、24、48 h分别收集A组细胞。采用含50%热损伤Fb培养上清的条件培养液培养Fb,于0、1、2、6、12、24、48 h收集细胞。采用实时荧光定量PCR检测各时间点KC热损伤条件培养上清对FbⅠ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA表达影响,以及Fb热损伤条件培养上清对Fb MMP-1mRNA表达影响。结果 KC热损伤条件培养上清培养24 h,A组Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA相对表达量均显著高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05)。培养2、6、12、24、48 h,A组Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA相对表达量均高于0 h(P<0.05),1 h与0 h差异无统计学意义(P>0.05);随培养时间延长相对表达量逐渐增高,2 h后各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Fb热损伤条件培养上清培养1、2、6、12、24、48 h,MMP-1 mRNA相对表达量与0 h比较,差异均有统计学意义(P<0.05);培养2 h后相对表达量逐渐降低,各时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论热损伤后KC培养上清对FbⅠ、Ⅲ型胶原及MMP-1的表达具有调控作用。     

热损伤角质形成细胞培养上清对真皮成纤维细胞增殖与胶原mRNA表达的影响

目的 观察热损(创)伤后角质形成细胞(KC)培养上清对真皮成纤维细胞(Fb)增殖与胶原mRNA表达的影响.方法 建立KC热损伤模型,收集正常及热损伤12 h后培养上清配制不同浓度的细胞条件培养液;分离培养人正常Fb,实验组分别加入含不同浓度的细胞条件培养液,以单纯DMEM组为对照,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定24 h后真皮成纤维细胞增殖;分别以流式细胞仪、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)测定DMEM组、50%浓度条件培养液组相同时间Fb生长周期及Ⅰ型胶原mRNA表达.结果 细胞增殖测定:热损伤上清(10%、30%、50%、70%)条件培养液组A值(0.151±0.004、0.165±0.009、0.195±0.006、0.202±0.008)均高于正常上清(10%、30%、50%、70%)条件培养液组(0.144±0.004,0.159±0.002,0.180±0.005,0.181±0.006)及对照组(0.144±0.007),除10%浓度组外各实验组A值与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为:4.01、11.42、11.41;P＜0.05),热损伤上清与正常上清条件培养液组比较:50%、70%浓度组间差异有统计学意义(t值分别为:2.03、1.94;P＜0.05);热损伤上清条件培养液50%与70%浓度组间差异无统计学意义(t值为1.34;P＞0.05).细胞周期测定见50%浓度热损伤上清组可明显促进Fb通过G1/S及S/G2限制点,S期及G2/M期细胞与对照组比较增多,G0/G1期细胞与对照组比较明显减少(t值分别为:5.87、11.3、4.86;P＜0.05).Ⅰ型胶原mRNA表达测定中,50%浓度热损伤上清组与对照组比较表达明显上调,差异亦有统计学意义(t=1.72;P＜0.05).结论 热损(创)伤后KC上清液可促进Fb的增殖,同时可上调Ⅰ型胶原mRNA的表达.

Abstract：

Objective To observe the effects of heat injured keratinocyte (KC) supematant on proliferation activity and collagen mRNA expression of the normal fibroblast (Fb).Methods A model of heat injured KC in vitro was reproduced,the supernatants of heat injured KC were collected and used as conditioned medium,and DMEM was used as control medium.Normal Fb were treated with different concentrations of conditioned medium.After treatment for 24 h,the proliferation activity,cell cycle and collagen Ⅰ mRNA levels in treated Fb were measured by using methylthiazol tetrazolium ( MTT),flow cytometry (FCM) and real-time polymerase chain reaction (PCR) techniques.Results As compared with the control group,the absorbance (A) values of MTT in treated groups were significantly increased (t = 4.01,11.42,11.41 ;P ＜0.05),except in 10% group (t = 1.34,P ＞0.05).As compared with normal supernatant treated group (0.159 ± 0.002,0.180 ± 0.005,0.181 ± 0.006),the A values in 50% and 70% conditioned medium group (0.195 ± 0.006,0.202 ± 0.008 ) were significantly increased ( t = 2.03,1.94;P ＜0.05).The 50% conditioned medium increased the percentage of G1 to S and S to G2 phase transit.As compared with control group,the number of cells in S and G2/M phase was increased significantly (t =5.87,11.3;P＜0.05 ) and that in G0/G1 phase decreased significantly ( t = 4.86;P＜0.05 ).Real-time PCR revealed that the collagen Ⅰ mRNA level in 50% conditioned medium group was significantly up-regulated (t= 1.72;P＜0.05 ) as compared with control group.Conclusion Heat injured KC supernatant may promote the proliferation of dermal Fb,and up-regulate the mRNA expression of collagen.     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

离体角质形成细胞热损伤模型建立及细胞凋亡观察

目的 建立离体KC热损伤模型,了解不同温度热损伤后KC凋亡情况.方法 体外培养人KC,分别以37、41、43、45、48、51℃孵育KC 10 min.用锥虫蓝染色初步观察KC死亡情况,Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡情况,应用流式细胞仪对细胞凋亡和死亡情况进行定量分析.采用噻唑蓝法检测热损伤对KC增殖活性的影响.结果 锥虫蓝染色、Hoechst 33258荧光染色、流式细胞仪检测结果 显示,随着热损伤温度的升高,KC中凋亡和死亡细胞逐渐增加;45℃时KC凋亡率和死亡率分别为(12.3±3.2)%、(14.1±1.6)%,48℃时各为(27.7±5.1)%、(58.0±4.2)%,51℃时KC死亡率高达(83.0±5.3)%.噻唑蓝法检测结果 显示,45℃热损伤条件下KC生长出现平台期.结论 热损伤能造成离体KC凋亡、生长受抑制,45℃孵育10 min为构建KC热损伤模型的较好条件.该模型可用于研究KC热损伤后的凋亡情况及其生物学特性.     

氧葡萄糖血清剥夺/再恢复诱导PC12细胞凋亡模型的建立

目的明确氧葡萄糖血清剥夺/再恢复(oxygen-glucose-serum deprivation/restoration,OGSD/R)诱导PC12细胞凋亡的变化趋势,建立稳定的细胞凋亡模型,为体外模拟脊髓缺血再灌注损伤导致神经细胞凋亡的研究提供实验工具。方法常规培养高分化PC12细胞,取对数生长期的细胞进行实验。以低糖不含血清的DMEM培养基于三气培养瓶(体积分数:95%N_2+5%CO_2,O_21%)培养12 h,然后换成高糖含血清DMEM培养基和普通培养箱继续培养,诱导PC12细胞凋亡。于复氧复糖复血清后0~6 h进行DAPI染色、CCK-8细胞活性检测及流式细胞术分析并检测相关凋亡蛋白caspase-3、caspase-12水平,比较不同时间点细胞凋亡的差异。结果 DAPI染色显示,OGSD 12 h/R 1 h细胞凋亡最重,凋亡细胞核固缩,形成较多颗粒光斑,凋亡严重的细胞破裂形成碎片,核解体。CCK-8活性检测表明在OGSD 12 h/R 1 h细胞活力最低。流式细胞术分析表明OGSD 12 h/R 1 h细胞凋亡率达到最大。凋亡蛋白检测结果提示在正常的PC12细胞中caspase-3、caspase-12含量极低,而在给予OGSD刺激后细胞内caspase-3、caspase-12的表达增强,复氧复糖复血清后2种凋亡蛋白表达进一步增强,caspase-12于OGSD 12 h/R 1 h时表达最强,caspase-3于OGSD 12 h/R 2 h表达最强。结论 OGSD可以诱导PC12细胞凋亡,且在复氧复糖复血清后细胞凋亡进一步加重;OGSD/R诱导PC12细胞凋亡具有时间依赖性,能有效模拟神经细胞缺血再灌注损伤病理生理过程,为脊髓缺血再灌注损伤的进一步研究提供实验模型。     

没药提取物对人成纤维细胞增殖与胶原mRNA表达影响的实验研究

目的 观察没药提取物对人皮肤Fb生物学特性的影响,探讨其促进创面愈合的可能机制. 方法 从人正常包皮组织中分离并培养Fb,取第3～5代细胞用于实验.(1)将Fb接种至96孔板,按随机数字表法分为对照组,1×10-4、1 ×10-3、1×10-2、1 ×10-1、1、10、1×102 g/L没药水提取物组以及上述7种浓度的没药醇提取物组.对照组用含体积分数0.25％小牛血清的DMEM培养液(简称低浓度血清培养液)培养,各浓度没药水及没药醇提取物组分别用含相应终浓度2种没药提取物的低浓度血清培养液培养.培养48 h,用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定各组Fb增殖活性(以吸光度值表示).(2)将Fb分别接种于培养瓶和培养皿中,均按随机数字表法分为2组:1 g/L没药水提取物组,用含终浓度1 g/L没药水提取物的低浓度血清培养液培养;对照组,采用低浓度血清培养液培养.培养72 h,分别采用流式细胞仪、实时荧光定量PCR法检测Fb周期与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达.对数据进行LSD-t检验. 结果 (1)各组细胞均呈长梭形生长,1 g/L没药水提取物组细胞融合较对照组更显著.1×10-3、1×10-2、1×10-1、1、10 g/L没药水提取物组Fb吸光度值分别为0.378±0.032、0.402±0.007、0.390±0.038、0.453±0.036、0.390±0.037,均高于对照组的0.332±0.044,t值分别为2.24、2.93、2.69、5.73、2.71,P值均小于0.05.1×10-4、1×102 g/L没药水提取物组吸光度值分别为0.312±0.048、0.154±0.009,前者与对照组比较,差异无统计学意义(t=2.84,P＞0.05);后者显著低于对照组(t =7.17,P＜0.05).1×10-3、1 ×10-1、1、10、1×102 g/L没药醇提取物组Fb吸光度值显著低于对照组(t值为2.30～24.79,P值均小于0.05).(2)1 g/L没药水提取物组G0/G1期细胞百分比为(74.3±6.3)％,明显少于对照组的(82.2±7.9)％,t=6.77,P＜0.05;S期及G2/M期细胞百分比分别为(16.6±3.4)％、(9.1±1.6)％,明显多于对照组的(13.3±2.3)％、(4.5±0.8)％,t值分别为7.53、6.34,P值均小于0.051 g/L没药水提取物组Fb中Ⅰ型胶原mRNA相对表达量(0.89±0.08)与对照组(1.00±0.06)比较,差异无统计学意义(t =1.17,P＞0.05);Ⅲ型胶原mRNA相对表达量(1.38±0.12)显著高于对照组(1.00±0.05,t=3.81,P＜0.01). 结论 没药水提取物能显著促进Fb增殖,加快Fb细胞周期进程,上调Fb中Ⅲ型胶原mRNA表达,可能与其促进创面愈合的机制相关.     

真皮组织微观化重建的探索性研究

目的 从微观角度探讨真皮基质三维结构对Fb生物学行为的影响.方法 借鉴平面几何、三角函数分析真皮组织三维结构,按照真皮组织由黏附成分和非黏附成分组成的原理,通过计算机辅助设计不同参数具有细胞黏着作用的点状结构阵列;运用微图案印刷和分子自组装法,建立4种(8μm×3 μm、间距6 μm,16 μm×3μm、间距6 μm,16 μm×5μm、间距8 μm,20 μm×3 μm、间距2 μm)具有细胞黏附点的桥墩样结构阵列细胞培养基质(MPGCC)培养人Fb,以无MPGCC培养的Fb为对照.利用免疫组织化学、荧光免疫组织化学、噻唑蓝法、羟脯氨酸含量测定法,检测培养Fb中骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达、细胞活力和细胞分泌情况.结果 数学推导结果提示,真皮组织三维结构可用MPGCC进行模拟.用上述4种规格MPGCC培养的Fb其α-SMA表达百分率依次为(49±3)%、(61±3)%、(47±4)%、(51±3)%,与对照组(12±3)%比较,差异有统计学意义(P<0.05);Fb活力依次为0.12±0.03、0.13±0.04、0.14±0.03、0.19±0.03,与对照组0.35±0.04比较显著下降(P<0.05);羟脯氨酸含量依次为(0.95±0.04)、(0.87±0.03)、(0.81±0.03)、(0.77±0.03)μg/mg,与对照组(0.53±0.03)μg/mg比较显著上升(P<0.05).通过调整桥墩角度和桥墩间阵列参数,4组阵列相互对比,α-SMA表达、细胞活力和羟脯氨酸含量差异均有统计学意义(P<0.05).结论 MPGCC可能是真皮模板的基本功能单位或称为真皮模板单元,不同的真皮组织三维环境可产生不同的模板效应和创面愈合结局.     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

重症急性胰腺炎腹水对正常肾细胞影响

目的通过观察重症急性胰腺炎(SAP)腹水对正常肾细胞影响,探讨SAP时急性肾功能损伤的机制。方法SD大鼠54只分成SAP组(n=30)和假手术组(n=24),SAP组以5%牛磺酸胆酸钠溶液胆管逆行注射诱导模型,术后6h、12h、24h采集血清、腹水。ELISA法检测血清、腹水TNFα水平,RT PCR检测肾细胞TNFαmRNA表达。将24h采集的血清和腹水处理体外培养NRK细胞,MTT法检测细胞活性,流式细胞术测定NRK细胞凋亡率。结果SAP组6h、12h、24h血清和腹水TNFα水平渐进性升高,各时间段差异显著(P<0.05)且较假手术后明显升高(P<0.01)。SAP组大鼠血清和腹水处理后NRK细胞活性均低于假手术组。SAP组大鼠腹水和血清处理24h后,NRK细胞培养液中TNFα水平较假手术组明显升高(P<0.01);NRK细胞TNFαmRNA表达上调,显著高于假手术组;凋亡率分别为29.67%±4.12%和59.95%±2.11%,假手术组大鼠血清和腹水处理24h凋亡率分别为3.72±2.90%和4.11±3.30%,差异显著(P<0.01)。结论SAP时肾损伤可能与肾细胞过度凋亡有关,而肾细胞过度凋亡与血清和腹水TNFα升高及肾细胞过多分泌TNFα有关,SAP腹水对肾的直接损伤可能比血清明显。     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

人脐血内皮祖细胞治疗裸鼠心肌梗死

目的 探讨人脐血内皮祖细胞(EPCs)移植治疗裸鼠心肌梗死的可行性.方法 采用淋巴细胞分离液提取人脐血单个核细胞(MNCs),应用添加诱导因子的培养基于体外诱导分化并于培养7 d后进行鉴定.采用20只裸鼠建立心肌梗死模型后,将体外诱导分化7 d并摄取CM-Dil的内皮祖细胞通过尾静脉注射进行细胞移植到实验组,对照组注射培养基.2周后计数心梗区域新生毛细m管密度及心梗面积并于荧光显微镜下观察新生血管的荧光.结果 体外诱导7 d后贴壁细胞CD34阳性率达(50.48±5.17)%,CDl33阳性率达(19.12±4.37)%.实验组平均梗死面积为(8.27±1.64)%,对照组为(14.30±2.84)%(t=-4.78,P<0.05);实验组每高倍视野平均新生血管密度为14.29±1.38,对照组为10.17±1.72(t=4.71,P<0.01);行荧光显微镜下观察实验组新生血管有红色荧光.讨论人脐血单个核细胞在体外诱导分化为内皮祖细胞,进行细胞移植到建立心梗模型的裸鼠后可在心梗区域形成新生血管,从而并改善梗死部位心脏功能.     

肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞增殖移行能力变化的影响

目的 观察烧伤血清所致肠上皮细胞增殖、移行能力的变化,以及联合应用肠三叶因子(ITF)和黏蛋白对其的影响.方法 将大鼠小肠上皮细胞株IEC-6传代培养,按照随机数字袁法分为正常对照组、烧伤血清组、ITF+烧伤血清组、黏蛋白+烧伤血清组和ITF+黏蛋白+烧伤血清组,均采用DMEM培养液培养,其内分别添加体积分数10％小牛血清、体积分数10％烧伤大鼠血清、25 μg/mL ITF和体积分数10％烧伤大鼠血清、250 μg/mL黏蛋白和体积分数10％烧伤大鼠血清以及联合使用上述剂量ITF、黏蛋白和烧伤大鼠血清.处理后0～4d观察细胞增殖能力;划痕实验后12、24、36、48、72 h观察细胞移行情况;Transwell法(细胞置于上室、培养液加入下室)培养4、6、8、10、12 h,观察细胞变形能力,以下室内细胞计数表示.对数据进行t检验.结果 (1)细胞增殖能力.处理后1～4d烧伤血清组细胞数量明显低于正常对照组(t值为-16.569 ～ - 2.613.P＜0.05或P＜0.01).ITF+烧伤血清组和黏蛋白+烧伤血清组细胞数量与烧伤血清组接近(t值分别为0.037～0 740、0.116～0.429,P值均大于0 05);处理后2d,ITF+黏蛋白+烧伤血清组细胞数量明显高于烧伤血清组(t =6.484,P＜0.01)、ITF+烧伤血清组(t =3.838,P＜0.01).(2)细胞移行能力.烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离均远远短于正常对照组(t值为-37.594～ -6.727,P值均小于0.0I).与烧伤血清组比较,黏蛋白+烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离无明显变化(t值为0.055 ～0.589,P值均大于0 05).ITF+烧伤血清组划痕后12、24、36 h细胞移行距离分别为(47±6)、(126±13)、(170±11) μm,明显长于烧伤血清组[(42±7)、(98±14)、(154±22) μm,t值为2.230～4.817,P＜0.05或P＜0.01].ITF+黏蛋白+烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离明显长于烧伤血清组(t值为2.982 ～7.390,P＜0.05或P＜0.01),划痕后12 ～48 h明显长于ITF+烧伤血清组(t值为2.707 ～2.918,P＜0.05或P＜0.01).(3)细胞变形能力.与正常对照组比较,烧伤血清组穿孔细胞数大幅减少(t值为- 23.965 ～ -6.436,P值均小于0.01).与烧伤血清组比较,黏蛋白+烧伤血清组各时相点穿孔细胞数改变不明显(t值为0.199～ 0.797,P值均大于0 05);ITF+烧伤血清组各时相点穿孔细胞数均明显增加(t值为3.650 ～10.028,P值均小于0.01).ITF+黏蛋白+烧伤血清组各时相点穿孔细胞数明显多于烧伤血清组(t值为4.313～15.100,P值均小于0.01),培养10、12 h时穿孔细胞数分别为(328±47)、(465±37)个,明显多于ITF+烧伤血清组[(277±25)、(353±34)个,t值分别为3.051、6 945,P值均小于0.01].结论 ITF对肠上皮细胞增殖影响有限,但能明显改善细胞变形能力,促进细胞移行;单独使用黏蛋白对细胞无明显作用,与ITF联合应用能增强ITF的作用.ITF维护肠黏膜屏障的主要机制为促进细胞移行.     

血竭素高氯酸盐对成纤维细胞增殖与成纤维细胞生长因子mRNA表达的影响

目的 观察血竭素高氯酸盐(Dp)对人皮肤成纤维细胞(Fb)生物学特性的影响,探讨其促进创而愈合的机制.方法 分离培养人正常Fb,将Dp以不同浓度(0.063、0.125、0.250、0.625、1.250、2.500 mg/L)分别加入培养液,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测Dp在不同浓度以及不同时间点对体外培养的Fb增殖作用的影响.通过流式细胞仪,实时荧光定量聚合酶链式反应( real-time PCR)分别检测最适浓度培养条件下Fb的细胞周期变化以及成纤维细胞生长因子(FGF) mRNA的合成表达.结果 Dp在0.625～1.250 mg/L浓度范围内,其吸光度值(0.237±0.012、0.243±0.017)均高于对照组(0.208±0.011)差异有统计学意义(t值分别为2.11、2.23,P＜0.05),此浓度范围可促进Fb增殖,且呈剂量依赖性,在浓度为1.250 mg/L时(A值0.243±0.017),促增殖作用最为显著(t =2.23,P＜0.01),流式细胞仪结果显示,在浓度为1.250 mg/L时,Dp可明显促进Fb通过G1/S及S/G2期限制点,S期及G2/M期细胞与对照组比较明显增多,G0/G1期细胞与对照组比较明显减少(t值分别为4.32、7.53、3.27,P＜0.05).细胞因子mRNA表达测定中,1.250 mg/L Dp组与对照组比较表达明显上调,差异亦有统计学意义(=1.48,p＜0.05).结论 Dp能显著促进Fb增殖,加快Fb周期进程,同时可促进FGF的mRNA表达,可能与血竭促进创面愈合的机制有关.     

胰高血糖素样肽1对骨骼肌成肌细胞增殖的调控及信号机制

目的 探讨胰高血糖素样肽l( GLP-1)对骨骼肌成肌细胞增殖的调控作用及其信号机制.方法 体外培养大鼠骨骼肌成肌细胞株L6,并按随机数字表法分为4组:(1)对照组,培养液中除常规成分外不再添加其他物质;(2)GLP-1组,培养液中加入终浓度10 nmol/L的GLP-1;(3)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂组,培养液中加人终浓度为50 nmol/L的PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素;(4) GLP-1 +PI3K抑制剂组,培养液中加入终浓度10 nmol/L的GLP-1和终浓度50 nmol/L的渥曼青霉素.各组细胞接受上述处理后分别继续培养24、48、72 h,采用噻唑蓝法测定细胞增殖活性(结果用吸光度值表示);继续培养24 h时,用流式细胞仪检测细胞周期分布,行免疫组织化学染色检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达,蛋白质印迹法检测磷酸化(p-)蛋白激酶B(Akt)、p-PI3K的蛋白表达水平.对实验数据行方差分析.结果 (1) GLP-1组细胞接受处理后48、72 h,增殖活性分别为0 660±0.120、0 870±0 240,均显著高于对照组(0.530±0 060、0.700±0 100,F值分别为5.46、5 90,P ＜0.05或P＜0.01).PI3K抑制剂组各时相点增殖活性均低于对照组.GLP-1+PI3K抑制剂组处理48、72 h,细胞增殖活性分别为0 510±0.080、0 740±0.160,与GLP-1组比较差异均有统计学意义(F值分别为5 46、5 90,P＜0.05或P＜0.01).(2)处理后24 h,GLP-1组S期细胞百分比为(15.7±0.4)％,显著高于对照组[(13.6±0.6)％]和GLP-1+ PI3K抑制剂组[(10 1±0 6)％];PI3K抑制剂组S期细胞百分比为(6 8±1.2)％,明显低于对照组.以上各项比较F值均为15 39,P值均小于0.01.(3)处理后24 h,GLP-1组细胞PCNA增殖指数为(51.24±1 18)％,显著高于对照组[(36.72±1.56)％]和GLP-1+ P13K抑制剂组[(25.90±1.22)％];PI3K抑制剂组PCNA增殖指数为(21.70±0.09)％,明显低于对照组.以上各项比较F值均为783 80,P值均小于0 05.(4)处理后24 h,GLP-1组细胞p-Akt蛋白表达水平显著高于其余3组,PI3K抑制剂组明显低于对照组.以上各项比较F值均为94.43,P值均小于0 01.GLP-1组、GLP-1+ PI3K抑制剂组p-PI3K蛋白表达水平与对照组接近(F值均为20 94,P值均大于0.05),PI3K抑制剂组较对照组明显降低(F=20.94,P ＜0.05).结论 GLP-1可直接作用于骨骼肌成肌细胞,通过加速细胞周期进程,增加DNA合成,促进细胞增殖.该作用与PI3 K/Akt信号途径密切相关.     

胰岛素干预后脂肪干细胞旁分泌对人血管内皮细胞的作用

目的 了解胰岛素刺激后脂肪干细胞(ADSC)旁分泌因子的变化及其对人血管内皮细胞的作用.方法 (1)分离培养人ADSC,按照随机数字表法将细胞分为胰岛素刺激组(含终浓度1×10-7mol/L胰岛素的无血清DMEM培养液培养)和对照组(未加胰岛素的无血清DMEM培养液培养),每组6孔.3 d后收集ADSC培养上清液(ADSC-CM),ELISA法测定血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)表达量.(2)分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),将细胞按照随机数字表法分为4组,均采用内皮细胞专用培养液培养:胰岛素刺激ADSC-CM组,培养液中加入经胰岛素刺激后的ADSC-CM;无刺激ADSC-CM组,培养液中含无胰岛素刺激的ADSC-CM;胰岛素组,培养液中加入终浓度为1×10-7mol/L的胰岛素;空白对照组,培养液中不添加刺激因素.3 d后噻唑蓝法测定HUVEC增殖情况,数据用吸光度值表示.(3)另取HUVEC同上分为4组,培养12 h时,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素双染色法测定细胞凋亡情况.(4)另取HUVEC同上分为4组后,体外细胞划痕法测定划痕后12、24、36、48 h时HUVEC迁移距离.对实验数据行t检验.结果 (1)胰岛素刺激组VEGF、HGF含量分别为(643±64)、(930±68)pg/mL,显著高于对照组的(287±47)、(577±84)pg/mL(t值分别为18.869、18.475,P值均小于0.05).(2)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组吸光度值分别为0.847±0.042、0.798±0.022,均高于胰岛素组的0.665±0.028(t值分别为4.579、3.732,P值均小于0.01)及空白对照组的0.674±0.031(t值分别为3.761、4.073,P值均小于0.01);胰岛素刺激ADSC-CM组吸光度值较无刺激ADSC-CM组明显增高(t=2.576,P＜0.05).(3)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率分别为(5.8±1.9)%、(9.0±2.0)%,均明显低于胰岛素组的(30.4±6.0)%(t值分别为12.891、10.417,P值均小于0.05)和空白对照组的(31.4±7.4)%(t值分别为11.474、9.783,P值均小于0.05);无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率高于胰岛素刺激ADSC-CM组(t=8.548,P＜0.05).(4)划痕后36、48 h时,胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组HUVEC迁移距离明显长于胰岛素组与空白对照组,且胰岛素刺激ADSC-CM组细胞迁移距离大于无刺激ADSC-CM组(t值分别为4.076、4.573,P值均小于0.05).结论 胰岛素干预后ADSC旁分泌能更有效促进人血管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡,有利于组织血管化.

Abstract：

Objective To study the biological effects of the paracrine from ADSC after being stimulated by insulin on vascular endothelial cells. Methods(1) ADSC was isolated from human adipose tissue and cultured in vitro. The third generation cells were collected and divided into insulin group (1, cultured with serum-free DMEM containing 1 × 10-7 mol/L insulin) and control group (C, cultured with serum-free DMEM) according to the random number table, with 6 slots in each group. Three days later, ADSC culture medium (ADSC-CM) was collected for determination of levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth fator (HGF) by ELISA. (2) Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured to the third generation, and they were cultured with special nutrient solution and divided into ADSC-CM with insulin stimulation group (AI) , ADSC-CM without insulin stimulation group (AC), insulin group(I, with same concentration as above), blank control group (BC) according to the random number table. Three days later, proliferation of HUVEC was determined with MTT method(with expression of absorbance value). Another two samples of HUVEC were respectively divided into 4 groups as above for determination of apoptosis rate with Annexin V/FITC double-staining 12 hours after culture, and H UVEC migration with scratch adhesion test at post scratch hour (PSH) 12, 24, 36, 48. Data were processed with t test.Results(1) Compared with those in C group [(287 ± 47) , (577 ± 84) pg/mL, respectively] , the secretion levels of VEGF and HGF in I group [(643 ±64) , (930 ±68) pg/mL, respectively] were significantly increased(with t value respectively 18. 869, 18. 475, P values all below 0.05). (2) The absorbance value of HUVEC in AI and AC groups was 0. 847 ± 0. 042, 0. 798 ± 0.022, respectively, which were higher than that in I and BC groups [0. 665 ± 0. 028(with t value respectively 4. 579, 3. 732) , 0. 674 ± 0.031(with t value respectively 3. 761, 4. 073) , P values all below 0. 01] , and that in AI group was higher than that in AC group(t =2.576, P ＜0.05). The apoptosis rates of HUVEC in AI and AC groups [(5.8±1.9)%,(9.0 ± 2.0)%, respectively] were obviously lower as compared with that in I and BC groups [(30.4 ±6. 0) %(with t value respectively 12. 891, 10.417),(31.4 ± 7.4) %(with t value respectively 11. 474,9. 783), P values all below 0. 05], and that in AC group was higher than that in AI group(t = 8. 548, P ＜0. 05). The distance of migration of HUVEC in AI and AC groups were greater than that in I and BC groups at PSH 36, 48, and that in AI group was greater as compared with that in AC group(with t value respectively 4.076, 4. 573, P values all below 0. 05). Conclusions Paracrine from ADSC after being stimulated by insulin can promote proliferation and migration of HUVEC, and suppress its apoptosis, and it is beneficial for tissue vascularization.     

烧伤患者深静脉导管细菌生物膜的形成及意义

目的 了解烧伤感染后金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌在深静脉导管中形成生物膜的过程.方法 选择2008年11月-2009年8月在笔者单位住院的20例烧伤患者深静脉导管分离的细菌,分别与各自的标准菌株对照.深静脉导管尖端行扫描电子显微镜(SEM)观察.将菌株体外培养12、24、48、72 h和5 d后,进行细菌生物膜半定量黏附试验测定,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)双荧光染色观察并测定生物膜厚度.对数据进行团体t检验.结果 深静脉导管分离的菌株为金黄色葡萄球菌6株、鲍氏不动杆菌8株、铜绿假单胞菌6株,均为耐药菌株.SEM下可见深静脉导管内层表面形态多样、程度不一的生物膜.细菌被大量胞外多糖复合物包埋、彼此粘连融合成片状,生物膜呈团状聚集,形成立体多样结构,结构内可见少量红细胞,少数细菌被不完全包埋,尚可见黏着的菌体.深静脉导管内分离的金黄色葡萄球菌体外培养24、48及72 h的吸光度值大于界定值;鲍氏不动杆菌培养12、24、48和72 h,吸光度值均大于界定值;铜绿假单胞菌培养48 h后,吸光度值开始大于界定值.CLSM观察可见,培养24 h时,除铜绿假单胞菌标准株外,其余菌株均有散在的绿色荧光,不密集,多数靠近培养皿基底部,红色荧光充满视野.48 h时绿色荧光明显增多,从基底部向上扩延,部分与红色荧光重叠,形成视野中黄色荧光,鲍氏不动杆菌最明显,其次是金黄色葡萄球菌.在绿色荧光的强度和分布上,临床菌株明显多于标准株.培养72 h时铜绿假单胞菌和其标准株的绿色荧光增多,其他菌株图像中黄色荧光布满视野.培养5 d时绿色荧光较分散,以靠近基底部较明显.金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌在培养后48 h形成成熟的生物膜,铜绿假单胞菌则在72h.培养后72 h鲍氏不动杆菌的生物膜厚度为(18.2±3.6)μm,大于标准菌的(9.4±2.6)μm(t=5.42,P<0.05),是3种菌中生物膜最厚者.结论 烧伤临床常见的金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌均能在深静脉导管内形成生物膜,其耐药菌株牛物膜形成能力和程度均大于普通菌株,以鲍氏不动杆菌尤为明显,成为烧伤后导管相关性感染的重要原因.     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及对TGF-β1诱导的大鼠肾系膜细胞α-SMA表达的影响

目的 构建骨形成蛋白7重组腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7.Adeno-BMP-7)及观察其对转化因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾系膜细胞(MC)α-SMA表达的影响.方法 构建Adeno-BMP 7并转染(M.O.I=100)大鼠肾系膜细胞,48h后用Western印迹法检测BMP-7蛋白的表达;分空白组.TGF-β1处理组(TGF-β1刺激24h,5ng/ml),Adeno-BMP 7转染组(TGF-β1刺激24h,5ng/ml;Adeno-BMP 7转染M.O.I=100),48h后用RT-PCR方法分别检测各组α-SMA的表达.结果 Western-blot检测示转染骨形成蛋白7重组腺病毒后的大鼠肾系膜细胞可表达BMP-7蛋白;RT-PCR示Adeno-BMP 7转染组α-SMA表达较TGF-β1处理组明显降低(Adeno-BMP 7转染组α-SMA/GAPDH值0.108,TGF-β1处理组α-SMA/GAPDH值0.112,P<0.05).结论 成功构建Adeno-BMP7,其转染能降低由TGF-β1诱导的大鼠肾系膜细胞α-SMA的表达.     

终末期糖基化终产物通过转化生长因子依赖和非依赖途径介导NRK52E细胞转分化和胶原Ⅰ的合成

目的探讨终末期糖基化终产物（AGEs）介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）Ⅰ合成的分子机制。方法体外培养正常大鼠近端肾小管上皮细胞系（NRK52E），应用自制的AGE-牛血清白蛋白（BSA）刺激NRK52E细胞。免疫细胞化学方法检测不同时间磷酸化（P）Smad2／3核转位情况。ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β1的水平。RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙黏着糖蛋白（cadherin）和ColⅠmRNA表达。Western印迹检测α-SMA、E-cadherin和ColⅠ蛋白的表达。同时观察TGF-β1中和抗体对AGE-BSA上述效应的阻断作用。结果基础状态下，NRK52E细胞存在低水平p-Smad2／3核表达（16％）。与BSA对照组比较，AGE—BSA以时间依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，其高峰出现在30min（68％比30.5％，P〈0．01）和24h（76％比31．3％，P〈0．01）。AGE—BSA显著上调α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达；下调E-cadherin mRNA和蛋白的表达；并能促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β1。TGF-β1中和抗体能明显抑制AGE—BSA介导的24hp-Smad2／3核转位（25．2％，P〈0．01），但不能阻抑30min活化高峰；能明显抑制AGE-BSA介导的α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达．以及显著地上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。结论AGEs通过TGF-β依赖和非依赖途径诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进其向肌成纤维母细胞转分化和ColⅠ的合成。