4种提纯弓形虫速殖子方法的比较研究

本文采用４种方法从小鼠腹水中提纯弓形虫速殖子，即：滤膜过滤法，纤维素过柱法、胰蛋白酶消化法和聚蔗糖泛影葡胺梯度离心法。４种方法均显示小鼠白细胞清除率均＞９５％。过滤或过柱法操作简单，但虫体回收率低；胰蛋白酶消化法虫体回收率最高，具有简便、经济的优点，可作为实验室常规大量纯化弓形虫方法。     

四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较

目的比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响。方法以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠,72h后收集小鼠腹腔液,以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF-11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子,用AGPC法抽提总RNA,用甲醛变性胶电泳检测总RNA。结果胰蛋白酶消化法虫体回收率最大,但时间长,易造成RNA降解;微孔滤膜过滤法回收率低;G3滤斗纯度不高;CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高,对RNA无影响。结论微孔滤膜过滤法、CF-11纤维素柱法对虫体RNA的影响小,较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化。     

弓形虫体外感染巨噬细胞的实验研究

观察弓形虫体外感染巨噬细胞及基在细胞内增殖的动态变化。用ＲＨ株刚地弓形虫感染小鼠腹腔Ｍψ，计算不同孵育时间的纳虫泡内虫体数，直线回归方程处理。弓形虫与Ｍψ的比例直接影响Ｍψ的感染率。弓形虫速殖子感染单层Ｍψ，只需１ｍｉｎ便可侵入，虫体侵入细胞至开始增殖，约经３ｈ的迟滞期，弓形虫增殖一所所需的时间为３．１３ｈ。     

弓形虫速殖子和包囊的分离纯化

采用植物血凝素P(PHAP)亲和凝集分离法自小鼠腹腔液内分离弓形虫速殖子,纯度达99.5％,收获率为73.2％。与胰蛋白酶消化法相比,前法对虫体无损伤。此外,应用淋巴细胞分离介质Ficoll-Paque密度梯度离心法自鼠脑组织内分离出较纯净的包囊。     

聚合酶链反应检测弓形虫核酸的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，设计了一对寡核苷酸引物，对弓形虫Ｂ１基因的保守序列进行体外扩增，显示该引物只对弓形虫核酸扩增，可对４个或４个以上弓形虫扩增出明显条带，检测弓形虫核酸的最低量为２．５ｐｇ。该ＰＣＲ对急性感染弓形虫的小鼠于４８ｈ后就可从部分小鼠（２／５）的外周血中检测到弓形虫核酸，９６ｈ后全部小鼠（５／５）外周血中的均检测到弓形虫核酸，而感染２４ｈ后可从其肝、脾、肾组织中扩增互弓形虫核     

阿奇霉素对体外弓形虫作用的实验研究

目的：了解阿奇霉素体外抗弓形虫的作用效果。方法：在细胞培养板里，将小鼠肾细胞作为弓形虫速殖子的滋养细胞，加入不同药物浓度的阿奇霉素(实验组)和乙酰螺旋霉素(阳性对照组)，用细胞计数和染色方法测定药物对弓形虫的抑制和杀灭作用。结果：药物作用72h后，当阿奇霉素浓度为0．625mg/L时，相对抑制率为13．12％，虫体死亡率为10．61％，乙酰螺旋霉素浓度为3．125mg/L时，相对抑制率和虫体死亡率分别为3．14％和0．85％。两种药物的浓度与作用效果均成正相关。结论：阿奇霉素对体外弓形虫具有抑制和杀灭作用，在常量药物浓度下，阿奇霉素对弓形虫的杀灭作用比乙酰螺旋霉素明显。     

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。     

扁桃酸治疗小鼠急性弓形虫病后肝细胞超微结构的变化

目的：观察扁桃酸对急性弓形虫病小鼠肝细胞超微结构的影响。方法：扁桃酸200mg/kg，2次/d，经口灌服或尾静脉注射治疗感染小鼠，于感染后24h、72h和死亡后分别解剖小鼠，取肝脏制作电镜标本，设立扁桃桃酸阴性对照和乙胺嘧啶药物对照组。结果：弓形虫阳性对照组小鼠肝细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀破裂，核膜迂曲，核固缩裂解，且破坏程度随感染时间延长而明显加重。扁核酸两治疗组肝细胞破坏程度均明显轻于相应时期的阳性对照组。扁桃酸对肝细胞内弓形虫速殖子也有明显的杀伤作用。乙胺嘧啶虽能有效杀灭虫体，但同时破坏不量肝细胞。结论：扁桃酸能减轻弓形虫对肝细胞的破坏，且副作用少，优于乙胺嘧啶。扁桃酸是高效低毒的抗弓形虫药物。     

激光照射弓形虫诱导的免疫保护力

本实验采用激光致弱弓形虫速殖子接种ＩＣＲ小鼠腹腔,以期提高小鼠抗弓形虫感染的免疫保护力。结果表明：激光照射能够抑制虫体的繁殖和分裂能力。照射虫体免疫小鼠能诱导产生持续升高的ＩgＧ抗体。免疫鼠经弓形虫ＲＨ株攻击后,其发病和死亡时间延长,表现出部分的免疫力。提示：激光对弓形虫速殖子的作用明显,可望在弓形虫形虫病的治疗和预防中得到应用。     

细胞内外弓形虫速殖子的形态观察

目的 观察细胞内（假包囊）、外弓形虫速殖子的形态差异。方法 收集小鼠腹腔内和体外培养中的细胞内、外弓形虫，染色后镜检，观察细胞内、外弓形虫速殖子的形态差异。结果 假包囊内的速殖子明显大于细胞外的速殖子，结构疏松，近圆形和椭圆形。随着繁殖数量的增加，虫体可排列成弧形及花瓣状。结论 细胞内、外弓形虫速殖子的形态差异较大。     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

弓形虫对小鼠肝脏的损害与蒿甲醚的保护作用

小鼠感染ＲＨ株弓形虫速殖子后２４ｈ，用肌注剂量为２５０ｍｇ／ｋｇ的蒿甲醚治疗，结果发现，未治疗组小鼠肝组织超微结构发生显著病理改变，主要表现为肝细胞间连接受损，脂滴增多，甚至胞质内细胞器广泛溶解，并可见较多虫体，而用药组小鼠肝细胞的形态基本正常，胞质内偶见虫体，其电子密度增高，明显固缩，内部结构不清。     

弓形虫慢性感染鼠形成包囊的实验研究

目的分别采用弓形虫Fukaya株速殖子和包囊感染小鼠,观察其脑内成囊情况,以期寻求一个稳定、易建立的慢性感染动物模型,为研究弓形虫的致病机理提供一个良好的实验工具.方法用弓形虫Fukaya株速殖子4×104个和包囊5～10个经腹腔感染昆明小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,统计小鼠的死亡率、脑内包囊数和成囊率.结果感染弓形虫速殖子组小鼠的死亡率为30%,脑内包囊数约为15个,成囊率为42.9%;感染弓形虫包囊组小鼠的死亡率、脑内包囊数、成囊率分别为0、40个和100%.接种包囊比速殖子小鼠死亡率低,脑内包囊数多,成囊率高.结论接种虫体感染阶段(包囊或速殖子)是影响成囊的重要因素,感染包囊小鼠脑内易成囊.     

金诺芬通过促进自噬对弓形虫增殖的影响

目的：金诺芬对弓形虫速殖子的作用及对弓形虫感染小鼠的自噬初步探讨。方法：透射电子显微镜观察用药前后刚地弓形虫超微结构的变化;采用免疫荧光、免疫组化和免疫印迹法检测感染有弓形虫的脑组织中自噬蛋白LC3的变化。HE染色观察金诺芬作用前后小鼠脑部的弓形虫速殖子变化。结果：透射电镜显示10 ?滋g/mL组（B组）的弓形虫速殖子内部结构被破坏,虫体细胞膜破裂,细胞质均质样改变,20 ?滋g/mL组（C组）的虫体内容物溢出,线粒体及粗面内质网消失,核固缩,核膜断裂,细胞质出现许多空泡,严重者虫体崩解呈均质样改变。免疫荧光结果显示实验组（77.49±15.68）的LC3蛋白的表达量较对照组（53.81±15.24）明显增加（P=0.001）。免疫组化结果显示用药后（1 208.55±580.07）的LC3蛋白表达量比对照组（544.54±225.04）明显增高（P=0.000）。免疫印迹法检测结果显示用药后（41 738.52±0.00）的LC3蛋白表达量比对照组（25 383.88±607.34）明显增高（P=0.000）。用药后（218.80±21.17）寄生在小鼠脑部的弓形虫速殖子增殖数量明显少于对照组（495.40±31.91）（P=0.000）。结论：金诺芬在体外有破坏弓形虫速殖子的作用,同时金诺芬可以提高弓形虫感染小鼠的自噬水平从而抑制弓形虫增殖。     

激光照射对弓形虫活力及免疫原性的作用

目的 观察激光照射对弓形虫活力及免疫原性的影响.方法 分别用经2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0 W/cm2光通量1 min激光照射的RH株弓形虫速殖子常规腹腔内感染BALB/c小鼠,观察存活小鼠体内弓形虫包囊的形成和抗体效价、弓形虫速殖子的活力及繁殖力.结果 4.5-6.0 W/cm2光通量激光照射后的虫体接种小鼠,小鼠全部存活,并能诱导IgG抗体的产生.此外,该光通量激光照射能使弓形虫的分裂繁殖及包囊形成抑制,活力明显减弱,死亡虫数增加.结论 激光照射能有效抑制弓形虫繁殖和分裂能力,照射后的虫体能有效诱导小鼠体液免疫应答.     

中药配伍治疗急性弓形虫病的研究

依据１２０种药抗弓形虫体外效应的初步报道,选择杀弓形虫速殖子作用较强的苍术、补骨脂,用正交设计方法进行治疗小鼠急性弓形虫感染的体内实验。比较以上４种中药不同浓度及其配伍的杀虫效果,找出它们的最佳配方,并与乙酰螺旋霉素的作用相比较。结果显示：中医药配伍中以萆解为首要药物,菘次是补骨脂,苍术和厚朴地位相似;在４种中药的９组配伍中,第３组小鼠的平均存活天数最长相当于乙酰螺旋霉素的８７％。     

刚地弓形虫感染昆明种及Babl/c小鼠的病理特征研究

目的 研究弓形虫感染昆明种及Babl/c小鼠的病理特征.方法 分别以刚地弓形虫速殖子感染昆明种及Babl/c小鼠,观察小鼠感染发病情况,并用病理组织切片,直接染色或免疫组化法检测小鼠体内弓形虫包囊或抗原.正常对照组小鼠未感染弓形虫.结果 两种小鼠对刚地弓形虫均易感,昆明种小鼠感染刚地弓形虫后2、3 d开始发病,感染后7～10 d死亡,死亡率95.00%;Babl/c小鼠于感染后4、5 d开始发病,呈一过性急性发作,绝大多数小鼠能度过急性期逐步恢复而长期存活,仅少数小鼠死亡,死亡率为10.00%.昆明种小鼠感染后主要表现为肝细胞变性、坏死、大量炎细胞浸润,小肠黏膜坏死脱落,腹腔内可见大量弓形虫速殖子;Babl/c小鼠在急性感染期表现为肝细胞水变性,腹腔内可见弓形虫速殖子,度过急性期后继续存活的小鼠体内虽未见到大量包囊、但在肝、脑等组织中可检出弓形虫抗原.对照组小鼠在实验期间无任何异常.结论 两种小鼠对刚地弓形虫的易感性不同,Babl/c鼠感染弓形虫后经历了急性和慢性感染的转换过程,是研究弓形虫感染与免疫的良好模型.     

常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响

目的了解常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响。方法将各种消毒剂分别加入等体积含弓形虫速殖子的小鼠腹水中，在不同时间内观察虫体胎盘蓝（trypanblue）着色率及活动率，并将经消毒剂处理不同时间的速殖予接种昆明鼠，观察速殖子能否在接种鼠体内复苏繁殖，导致小鼠死亡。用类似方法观察自来水时速殖子的影响。结果除甲醛个速殖子在常用浓度的不同消毒剂中，lmin月台盘蓝着色率均为100％，活动率为0。经消毒剂处理1min的速殖子接种小鼠后，各组接种鼠（包括甲醛处理组）无一死亡。经自来水处理4h的速殖子接种小鼠后仍能在小鼠体内复苏繁殖，小鼠于接种1wk内全部死亡。结论弓形虫速殖子对常用消毒剂均很敏感；而在自来水中途殖子可保持感染力4h以上。     

经口感染弓形虫在小鼠组织内的动态分布

目的 观察经口感染弓形虫速殖子在小鼠小肠组织、实质器官内的动态分布.方法 BALB/c小鼠96只,随机分为8组,0d组用0.5ml PBS/只灌胃,其余组用RH株弓形虫速殖子1×104个灌胃感染,感染后2、4、6、8、10、12、14d处死小鼠,每次处死12只,取十二指肠、空肠、回肠、肝脏、脾、肾、肺、心和脑做组织印片,吉-瑞氏染色,镜检.结果 感染后2d 在十二指肠、空肠、回肠、肺和心,4d在脾,6d在肾和肝脏发现虫体,脑内未发现虫体.十二指肠、空肠、回肠组织内虫体数量呈上升趋势,第6天达高峰后稍有下降.肝内虫体数量呈上升趋势,第6天最多;脾内虫体数量在6d达峰值后保持较高水平;实验期间肾、肺和心内虫体数量保持较低水平.结论 弓形虫经口感染小鼠后2d,小肠组织出现大量速殖子;同时肺和心内有少量速殖子;4d在脾、6d在肾和肝脏发现虫体;速殖子在上述组织内增殖,并形成假包囊,脑内未发现虫体.     

上海市卫生系统实验动物弓形虫感染调查

用间接血凝试验法对本市卫生系统一些单位的实验大鼠、小鼠、豚鼠和仓鼠进行了弓形虫血清抗体检测。共检测９２４份血清标本，阳性标本４５份，阳性率为４．９％。其中普通级豚鼠的血清阳性率最高，为２２．４％（１９／８５）。