Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响

目的应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA（siRNA）干扰片段,通过调控其表达,研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。 方法从结肠癌细胞中扩增Rac1基因,构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因;通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变;通过Pull-Down实验,研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。 结果成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1 GTPase的活化程度,以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。 结论通过抑制Rac1的表达,可以有效阻止Rac1 GTPase的激活,从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭,为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点,也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

p21saRNA真核表达质粒的构建及其在泌尿系肿瘤细胞中的功能

目的 构建可表达具有RNA激活功能的小分子双链RNA(dsRNA)真核表达质粒,并探讨其调控前列腺癌细胞株PC-3和膀胱癌细胞株T-24中抑癌基因p21 WAF1/CIP1表达的功能.方法 构建真核表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1,并分别转染至PC-3和T-24细胞株,通过实时定量聚合酶链反应( Real-time qPCR)和Western blot检测p21mRNA转录水平和蛋白表达的变化.结果 测序结果证实目的表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1构建成功,将其转染入PC-3细胞和T-24细胞中,Real-time qPCR检测p21基因分别被上调4.35倍和2.83倍,Western blot进一步证明在两种细胞株中p21蛋白表达水平的增加与p21mRNA水平的上调一致,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的dsRNAP21-pGenesil-1质粒具备在泌尿系肿瘤中上调抑癌基因p21表达的能力.     

大肠癌转移相关基因骨桥蛋白反义及正义真核表达质粒的构建

目的 构建大肠癌转移相关基因骨桥蛋白(OPN)反义和正义真核表达质粒。方法 运用PT-PCR技术分别克隆两种OPN cDNA序列:pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)和pGEM-T Easy-OPN（ORF），并由此构建两种重组真核表达质粒：peDNA3．1( )-OPN(201bp)反义真核表达质粒和peDNA3．1( )-OPN(ORF)正义真核表达质粒。结果 OPN反义和正义真核表达质粒构建成功。结论 两种真核表达质粒的构建成功，为进一步研究OPN与大肠癌肝转移的相关性提供了实验平台。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

靶向Notchl基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向Notchl基因的siRNA真核表达载体.方法:根据Notchl基因cDNA序列,设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列,将其插入U6启动子下游,克隆到真核表达载体pGsensil中,并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定.采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中,荧光下观测转染效率.RT-PCR检测Notchl基因mRNA在转染前后的表达.结果:转染48 h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notchl mRNA的表达.酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确.结论:成功构建的靶向Notchl的siRNA真核表达载体,具有抑制Notchl基因mRNA表达的功能,可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向.     

小鼠生长激素促分泌素受体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的 构建小鼠生长激素促分泌素受体(GHS-R)真核表达系统,并观察其在瞬时转染的COS-7细胞系中的表达情况.方法 以小鼠基因组为模板,通过拼接PCR技术(SOE-PCR)克隆出GHS-R的编码序列(CDS),插入真核表达载体pcDNA3中,构建重组真核表达质粒pcDNA3-GHS-R,酶切鉴定并测序,瞬时转染COS-7细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的 蛋白.结果 成功扩增了小鼠GHS-R编码序列(CDS),酶切和测序证明pcDNA3-GHS-R构建正确,Western Blot方法证实转染的该质粒能在COS-7细胞中正确表达目的 蛋白.结论 成功构建了小鼠GHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础.     

TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

目的 构建睾丸特异表达基因2(TSEG-2)的真核表达载体,探讨TSEG-2在细胞中的表达及其生物学功能.方法 以小鼠睾丸组织cDNA为模版,设计携带HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点的引物序列,聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段,克隆至携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1;在阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd 48 h后,荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长活性,AO/EB荧光染色法、Hoechst 33258荧光染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR测定Fas、bcl-2、bax表达水平.结果 成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP-TSEG2,转染GC-2spd细胞后可见胞质内绿色荧光蛋白表达.转染pEGFP-TSEG2 48 h后,GC-2spd细胞生长抑制39.2%(P＜0.05),出现细胞凋亡形态学改变,凋亡率为28.3%(P＜0.05);GC-2spd细胞中Fas和bcl-2的表达分别下调17.9%、64.8%(P＜0.05),而bax的表达上调25.1%(P＜0.05).结论 成功构建TSEG-2基因的真核表达载体,能在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡.     

靶向Notch1基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定靶向Notch1基因的siRNA真核表达载体。方法：根据Notch1基因cDNA序列，设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中，荧光下观测转染效率。RT-PCR检测Notch1基因mRNA在转染前后的表达。结果：转染48h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notch1 mRNA的表达。酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论：成功构建的靶向Notch1的siRNA真核表达载体，具有抑制Notch1基因mRNA表达的功能，可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向。     

p21^waf1基因真核表达载体的构建和对人胆管癌细胞生长 …

目的 探讨ｐ２１＾ｗａｆ１基因过表达在人胆管癌细胞增殖和凋亡中的作用。方法 包含２．１ｋｂ的ｐ２１＾ｍａｆ１ｃＤＮＡ片段经阳离子脂质体ＤＯＴＡＰ包裹转染人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９中，并得到稳定表达，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、流式细胞仪及免疫组织化学等方法检测ｐ２１＾ｗａｆ１基因表达、细胞生长和细胞凋亡等情况。结果 ｐ２１＾ｗａｆ１基因转染后，细胞生长明显受抑制，细胞     

大鼠半胱氨酸蛋白水解酶-3基因真核表达质粒和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的 构建SD大鼠半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的真核表达质粒和干扰质粒,探究干扰质粒对Caspase-3表达的干预效应。方法 从SD大鼠软骨终板细胞中获得模板cDNA并扩增,约834 bp。克隆至载体pEGFP-N1,获得重组质粒pEGFP-N1-Caspase-3。针对Caspase-3设计4对RNAi靶点序列,克隆至载体pcDNA6.2。成功构建pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3、pcDNA6.2-Caspase-3-4,构建对照质粒pcDNA6.2-miRNA。将5个干扰质粒分别与pEGFP-N1-Caspase-3(用量比为7:1)共转染至293T细胞,qPCR检测转染48h后对Caspase-3表达的干预效应。结果 通过菌落聚合酶链反应(PCR)、酶切及测序表明pEGFP-N1-Caspase-3和干扰质粒构建成功;共转293T细胞后,qPCR示pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3干预组的Caspase-3的表达高于对照组,分别为33％和8％,而pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-4干预组的Caspase-3的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别为24％和67％ (P ＜0.05)。结论 成功构建了Caspase-3的表达质粒和干扰质粒,并证实pcDNA6.2-Caspase-3-4对Caspase-3的表达具有明显的抑制效应。     

人TRPC1基因真核表达载体的构建及肝细胞表达

目的 构建人TRPC1基因真核表达载体,并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法 提取细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)得到TRPC1基因的编码序列,经纯化回收后克隆入表达载体pGM-T中,酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,最后转染HL-7702细胞,通过电泳和噻唑蓝(MTY)比色法检测基因表达与细胞生长.结果 扩增片段长度为455 bp,重组质粒pGM-T-TRPC1经酶切鉴定条带位置正确,证明表达载体成功构建.电泳结果显示转染重组质粒后的HL-7702细胞表达TRPC1增强.MTF检测发现转染前后肝细胞生长未受到明显影响(t值分别为0.43、-0.40、-2.01、-1.60、-0.41和-0.72,P值均0.05).结论 成功构建人TRPC1基因的真核表达载体pGM-T-TRPC1,并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达.     

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrp）基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp.[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2.1 TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2.[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒.[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础.     

人反义VEGF121真核表达质粒的构建及其对胰腺癌细胞VEGF表达的影响

血管内皮生长因子(VEGF)能特异性地刺激血管内皮细胞增殖，在肿瘤的血管生成中发挥着关键作用。胰腺癌作为实体瘤其发生、发展与肿瘤血管生成有着密切的联系。本研究采用分子生物学方法构建人反义VEGF121真核表达质粒，并转染人胰腺癌细胞系BxPC-3，为通过抑制VEGF引起的血管生成来抑制胰腺癌的增殖提供了实验基础。     

小鼠成纤维活化蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维活化蛋白(FAP)基因的真核表达载体,并检测其在人胚肾细胞及小鼠体内的表达.方法 根据Gene Bank中mFAP基因(NM_007986)全序列设计聚合酶链反应(PCR)引物,获得其开放式阅读框(ORF).将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6/myc-His-B,转化并筛选.将重组质粒注射入小鼠尾静脉,在注射后1、3、5、7 d抽提小鼠腓肠肌组织的总RNA,检测FAP表达.结果 经过酶切鉴定、测序比对,确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子,其可在真核细胞及小鼠体内正常表达,并产生相应蛋白质产物.在小鼠体内注射后第5天,重组子的基因(0.841±0.040)和蛋白表达量(85.380±4.425)%最高,和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建FAP真核表达载体,为研究该基因产物的功能和进行疫苗抗肿瘤实验提供基础.     

pTRE-2hyg-HBX质粒的构建和初步表达鉴定

目的:构建含HBV(hepatitis B virus)X基因的真核表达载体pTRE-2hyg-HBX,从而建立Tet-On表达系统,研究HBX基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌(HCC)的发生和发展的关系.方法:用PCR方法扩增含MIuI和SalI内切酶位点的X基因序列全长,对pTRE-2hyg载体和X基因的PCR产物进行双酶切(MIuI和SALI内切酶),将两者连接,转化大肠杆菌DH5α并提取转化子pTRE-2hyg-HBX,对其进行测序及其RT-PCR功能学检测.结果:已构建的pTRE-2hyg-HBX经测序包含有完整的X基因的片段并能表达.结论:构建成功pTRE-2Ehyg-HBX载体,可用于和pTET质粒共转化细胞系建立可调控的Tet-On表达系统,用于研究X基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌的发生和发展的关系.     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

BMP2和TGFβ3双基因真核表达载体的构建

[目的]构建骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体.[方法]从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以pGEMT/BMP2和反转录的cDNA为模板,PCR扩增出BMP2和TGFβ3两个基因全长,将两个基因片段分别定向连入双基因真核表达载体pIRES;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定.[结果]酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确.[结论]成功构建pIRESBMP2/TGFβ3双基因真核表达载体.     

鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建

目的 构建肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体,为深入研究MyoD在肌肉修复中的分子调节机制,探讨其在肌肉损伤方面的生物学行为,为临床应用提供物质基础。方法 含MyoD cDNA的质粒PEMMBC2 β5于大肠杆菌E.Coli DH5a内扩增;提取及纯化PEMMBC2 β5质粒;经DNA序列分析含MyoD cDNA;限制性酶切MyoD cDNA片段,连接酶连接到真核表达质粒pcDNA3-neo内,克隆出真核表达载体pcDNA3/MyoD。结果 提取及纯化的PEMMBC2 β5质粒含有大小正确的MyoD cDNA碱基片段,其碱基序列为编码目的基因的正确序列,凝胶电泳结果证明已将此片正确地克隆到pcDNA3/MyoD内。结论 成功的构建了MyoD基因的真核表达质粒pcDNA3/MyoD。     

OX40-IgG1融合基因重组表达载体的构建及鉴定

目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-0X40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备.方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人0X40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-0X40Ig重组质粒.构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NIH/3T3细胞.以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40Ig融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR,双酶切及测序鉴定正确.SDS-PAGE与Western Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符.体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR.结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础.