阻断内源性bcl-2蛋白表达提高BcaCD885颊癌细胞热敏感性的研究

目的：探讨与bcl—2翻译起始部位碱基互补的反义bcl—2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucletide，ODN)对BcaCD885颊癌细胞热敏感性的影响。方法：以脂质体Lepofectin加为载体，转染20μM反义bcl—2 ODN于BcaCD885细胞内，阻断内源性bcl—2蛋白表达，再以43℃40min加热后，以流式细胞术—抗体及DNA分析对bcl—2蛋白、bax蛋白和细胞凋亡进行检测。结果：反义bcl—2 ODN阻断BcaCD885细胞内源性bcl—2蛋白表达后，bax／bcl—2升高，细胞凋亡率明显提高。结论：阻断BcaCD885细胞内源性bcl—2蛋白表达能提高其热敏感性。     

反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞凋亡的影响

目的 探讨反义bel-2寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）对BcaCD885细胞凋亡的影响。方法 以脂质体 Lepofection为载体,一过性转染20μmol/L反义及正义bel-2 ODN于BcaCD885细胞后,通过细胞形态观察及流式细胞术（FCM）分析,从形态学及细胞学水平对凋亡细胞进行检测。结果 20μmol/L反义bel-2 ODN转染组,细胞出现了凋亡形态学改变,FCM检测凋亡率与对照组间存在显著差异（P<0.05）。而 20μmol/L正义bell-2ODN转染组与对照组相似,在形态学上未见明显的凋亡细胞出现,FCM检测两者凋亡率不存在显著差异（P<0.05）。结论 反义 bel-2 ODN能促进 BcaCD885细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子-α诱导腺样囊性癌细胞凋亡中p53和bcl-2基因的表达

目的　探讨肿瘤坏死因子 (TumorNecrosisFactor -alpha ,TNF -α)诱导体外人涎腺腺样囊性癌(Salivaryadenoidcysticcarcinoma ,SACC)细胞凋亡过程中P5 3与bcl- 2蛋白的表达 ,以揭示TNF -α诱导的凋亡与癌基因表达间的相互关系。方法　SACC细胞于RPMI 16 40培养液 (含 10 %胎牛血清 )中 ,37 C恒温孵育。实验组用TNF -α处理 ;对照组只加入胎牛血清作为对照。实验组与对照组均分别于 2 4、48、72小时取出细胞爬片 ,免疫组化 (SP法 )检测P5 3与bcl- 2蛋白的表达情况。结果　经TNF -α处理的SACC细胞 2 4小时后 ,细胞出现胞体变小 ,胞核固缩的凋亡早期的形态学改变。P5 3和bcl - 2蛋白表达检测 ,经RelativeIdentifiedDistributionunit(RIDIT)分析表明 ,在 2 4、48、72小时 ,实验组P5 3蛋白的高染率分别为 5 %、2 5 %、5 5 % ,bcl- 2蛋白为 15 %、2 0 %、35 % ;在 48、72小时 ,实验组与对照组均存在显著性差异 (P <0 .0 1) ;且P5 3蛋白的高染率与相应时间段的细胞凋亡率有相关性 (P <0 .0 1) ,而bcl- 2蛋白的高染率与相应时间段的细胞凋亡率无相关关系 (P >0 .0 5 )。结论　在TNF -α诱导SACC细胞凋亡的早期阶段 ,P5 3及bcl- 2蛋白表达均增强。     

硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响

目的　探讨硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸(AS-sODN)对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响。方法　以脂质体Lipofectin为载体,转染AS-sODN于BcaCD885细胞内,倒置显微镜观察细胞形态学改变,TUNEL原位末端标记检测细胞凋亡,流式细胞技术(FCM)测定细胞凋亡率及Bcl-xL蛋白表达水平;转染AS-sODN于BcaCD885 细胞内,再以43℃,40 min加热细胞,FCM检测细胞凋亡率。结果　AS-sODN转染后,BcaCD885颊癌细胞出现皱缩、呈浮起状,TUNEL原位末端标记阳性,Bcl-xL蛋白表达明显下降(P<0·05),热诱导细胞凋亡率明显提高(P< 0·05)。结论　硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸能诱导BcaCD885颊癌细胞凋亡并能提高其热敏感性。     

周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin表达的影响

目的:研究在机械力作用下人牙周膜细胞(h PDLCs)内Periositn(PN)m RNA和蛋白的表达变化。方法:采用组织块酶消化法培养h PDLCs,经鉴定后将第4代细胞随机分为4个实验组和1个对照组(非加力组),4个实验组分别采用Flexcell-5000 Tension System应力加载系统对h PDLCs加载6、12、24、48 h的周期性张应力;然后采用q RT-PCR、Western blot分别检测各组h PDLCs中PN m RNA和蛋白的表达变化。结果:在正常h PDLCs中表达PN m RNA和蛋白;与对照组相比,加力6 h后,PN m RNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);加力12 h后,PN m RNA和蛋白的表达均逐渐升高,并持续至24 h达最高水平(P<0.05);而在加力48 h时,PN m RNA和蛋白表达均明显下降,并恢复至对照组的表达水平(P>0.05)。结论:机械力可诱导h PDLCs中PN的表达增强及活化,且具有时间依赖性;提示PN可能参与了细胞内生物力学信号的转导。     

细胞凋亡抑制基因bcl-2在牙源性病损中表达的研究

目的　观察凋亡相关基因bcl- 2在成釉细胞瘤 (Ameloblastoma,AB)和牙源性角化囊肿 (OdontogenicKeratocyst,OKC)中的表达 ,探讨其与AB和OKC的生物学意义。方法　应用免疫组化法 (S -P)检测 75例AB(原发 31例 ,复发 37例 ,恶变 7例 ) ,35例OKC及 9例口腔正常粘膜。同时采用原位杂交法检测了 2 0例AB(12例原发 ,8例复发 ) ,12例OKC中的bcl- 2mRNA。结果　 88% (6 6 / 75 )AB ,74.2 % (2 6 / 35 )OKC ,44 .4% (4 / 9)正常口腔粘膜有bcl- 2蛋白表达 ,三组间相比差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。同样在原发组AB 77.4% (2 4/ 31) ,复发组AB94.5 % (35 / 37) ,恶性组AB10 0 % (7/ 7)。bcl- 2阳性率及阳性强度随着组织学分级变化而增加 ,组间统计 (P <0 .0 5 )。在 2 0例AB及 12例OKC中bcl- 2mRNA表达趋势与bcl- 2蛋白的表达是相一致的 (P <0 .0 1)。bcl- 2阳性表达与AB不同组织学分型 ,病损发生部位 ,肿瘤生长方式 (单房与多房 )无关 (P >0 .0 5 )。bcl- 2在病变中表达的特征为AB的外周层细胞为强表达 ,星网状层有阳性表达 ,随着细胞增殖分化呈实性片状时bcl- 2表达增强 ,角化退变样细胞 ,颗粒性变细胞表达缺失。OKC中多在基底层细胞中表达。结论　①bcl- 2在AB及OKC的发生、发展及细胞分化与增殖中起着重要作用。     

骨形成蛋白-2对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量的影响

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1蛋白的表达及骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP2)对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量影响，方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理6h,12h,24h,48h后，提取总蛋白质，采用Western Bolt法，从翻译水平观察Smad1基因的表达变化。结果：从翻译水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用48h内，Smad1蛋白表达量无显著变化，结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量不受MBP2影响。     

siRNA沉默小鼠原代成骨细胞LIMK2基因的实验研究

目的 探讨采用RNA干扰抑制原代成骨细胞中LIMK2的表达及其抑制效率,为进一步研究LIMK2基因的作用奠定基础.方法 针对小鼠LIMK2基因,化学合成3条siRNA,分别编号为R1、R2、R3,用脂质体分别介导转染到小鼠原代成骨细胞中,转染后24、48 h提取细胞的总RNA和总蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,研究3条siRNA 在不同时间点对LIMK2基因的抑制效率.结果 RT-PCR结果 显示编号为R3的siRNA对LIMK2 mRNA表达的抑制效率最高,两组应用R3 siRNA后的LIMK2 mRNA表达量分别为对照组的19.30%(转染后24 h)、18.63%(转染后48 h);Western blot检测显示编码为R3的siRNA对LIMK2蛋白表达的抑制效果最明显,两组应用R3 siRNA的LIMK2蛋白表达量分别仅为空白对照组的1.32%(转染后24 h)、1.19%(转染后48 h).结论 编号为R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达.     

人端粒酶逆转录酶与bcl-2在成釉细胞瘤中的表达

目的　研究成釉细胞瘤(AB)中人端粒酶逆转录酶(hTERT)和bcl-2的表达。方法　采用原位杂交或免疫组化方法对AB(分原发、复发和恶变组)中hTERTmRNA和bcl-2进行检测,并与正常口腔黏膜作对照。结果　 hTERTmRNA阳性表达率在AB中为94·4%,正常口腔黏膜中为14·3%(P<0·001);bcl-2蛋白阳性率在AB中为 88·0%,正常口腔黏膜中为44·4%(P<0·001)。从表达趋势看伴随着AB的复发与恶变,hTERTmRNA与bcl-2表达均增强(P<0·05)。结论　端粒酶和bcl-2可作为评价AB预后的有效指标。端粒酶的活化和bcl-2表达的增强在 AB的发生、发展中起着重要作用。     

口腔鳞癌细胞中bcl-2、bax的量子点双标免疫荧光成像研究

目的:利用量子点对口腔鳞癌细胞内bcl-2、bax蛋白进行双标免疫荧光成像研究。方法:利用量子点QD605和QD545通过双标免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2、bax蛋白同时观察识别。结果:不同粒径量子点可同时对舌癌细胞bcl-2、bax蛋白特异性识别,在激光共聚焦显微镜下观察到舌癌细胞bcl-2和bax蛋白高表达。QD605标记的bcl-2蛋白表现为红色荧光,QD545标记的bax蛋白表现为绿色荧光,2种蛋白在细胞内同一位置重叠呈现黄色荧光。激光连续照射1 h,3种颜色的荧光均未明显衰减。结论:量子点能同时对细胞内的2种蛋白进行双标免疫荧光成像。     

人颊癌BcaCD885细胞Fas表达水平与移植瘤形成和增殖的关系

目的 :研究Fas表达水平与人颊癌BcaCD885细胞移植瘤形成、增殖及凋亡的关系 ,探讨其相关机制。方法 :用脂质体将真核表达重组质粒pBK -Fas导入人颊癌BcaCD885细胞。转染 72h后 ,收集转染及未转染细胞 ,每组细胞分别接种 10只裸鼠。观察移植瘤形成及增殖状况 ,绘制肿瘤生长曲线。实验结束采集肿瘤标本 ,称重 ,计算肿瘤生长抑制率。同时以RT -PCR检测两组移植瘤细胞FasmRNA表达 ,流式细胞仪检测移植瘤细胞凋亡、增殖和Fas蛋白表达。结果 :Fas转染组移植瘤形成时间平均延长 3 .4d ,各观察点移植瘤体积均小于未转染组 ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1)。RT -PCR和流式细胞术检测显示 ,Fas转染上调FasmRNA表达 ,提高Fas蛋白阳性表达率、阳性表达强度和细胞凋亡指数 ,但不影响肿瘤细胞增殖指数。结论 :Fas基因转染抑制移植瘤形成和增殖与提高Fas表达、增加肿瘤细胞凋亡有关。     

下调性别决定区Y框蛋白9对口腔鳞癌细胞上皮间质转化及克隆能力的影响

目的 探讨下调性别决定区Y框蛋白9（SOX9）对口腔鳞癌（OSCC）细胞上皮间质转化（EMT）及克隆能力的影响。方法 OSCC BcaCD885细胞中转染siRNA control、SOX9 siRNA,同时以不做任何转染的细胞作为control组。实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot筛选干扰效果较好的SOX9 siRNA1做后续研究。细胞克隆实验测定细胞克隆形成能力,免疫荧光检测上皮钙黏附素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达,Western blot检测E-cadherin、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Vimentin、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移。结果 SOX9 siRNA组细胞中SOX9 mRNA和蛋白水平均明显低于control组（P<0.05）。SOX9 siRNA1细胞克隆形成数目、细胞侵袭和迁移数目明显降低,并且细胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平也明显降低,与control组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。SOX9 siRNA1组细胞中Vimentin表达水平降低,而E-cadherin表达水平升高,细胞EMT受到抑制,与control组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 下调SOX9可抑制OSCC细胞EMT和克隆形成,以及细胞侵袭和迁移。     

人工合成小干扰RNA抑制涎腺腺样囊性癌DNA甲基转移酶1的表达

目的通过筛选针对涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）DNA甲基转移酶1（DNA methyhransferase 1，DNMT-1）基因有效的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）序列和分析RNA干扰（RNA interference，RNAi）作用的时效、量效关系，为建立ACC稳定抑制DNMT-1的表达载体，深入了解DNMT在ACC抑癌基因甲基化过程中的作用。方法设计并人工合成4对siRNA，脂质体介导分别转染ACC细胞系ACC-2、ACC-3和ACC-M细胞，分别于转染后24、48和72h，采用PCR、RT-PCR和Western blot方法检测各细胞系DNMT-1的mRNA和蛋白表达，筛选有效的siRNA干扰序列，同时设置siRNA不同浓度转染组，分析RNAi作用的量效关系。以Cy3标记甘油醛-3-磷酸脱氢酶siRNA作为阳性对照组。结果2对siRNA对3株ACC细胞系细胞DNMT-1的mRNA表达产生了抑制作用，它们分别使ACC-2、ACC-3、ACC-M DNMT-1表达抑制67％、86％、92％和76％、76％、86％，抑制作用出现的时间为转染后24～48h，维持24～48h，与siRNA浓度成正比，Western blot检测符合mRNA的检测结果。结论得到了2对针对ACCDNMT-1基因有效的siRNA干扰序列。它们能显著抑制涎腺ACC细胞系DNMT-1的mRNA和蛋白表达，该抑制作用具有时间依赖性和浓度相关性。     

半乳糖凝集素-3基因在口腔鳞状细胞癌增殖、侵袭、凋亡中的作用及机制研究

目的 探讨抑制口腔鳞状细胞癌（OSCC）中半乳糖凝集素-3（Galectin-3）基因的表达对癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及机制。方法 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）分别检测OSCC中Galectin-3 mRNA和蛋白表达;人OSCC Tca8113分为空白组、阴性对照组和Galectin-3转染组,转染48 h后,Western blotting检测各组细胞中Galectin-3、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、β-连环蛋白（β-catenin）、细胞周期素D1（Cyclin D1）蛋白表达;CCK8检测细胞增殖;Transwell小室检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 OSCC中Galectin-3 mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织（P<0.01）;RNA干扰Galectin-3表达后Tca8113细胞中Galectin-3蛋白表达明显降低;Galectin-3转染组细胞存活率、细胞侵袭能力及MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达均显著低于空白组,细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著高于空白组（P<0.01）。结论 抑制OSCC中Galectin-3基因表达可显著降低癌细胞的增殖及侵袭能力,诱导细胞凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

核因子-κB传导通路与舌癌细胞平阳霉素化疗敏感性的关系

的 探讨核因子-κB（NF-κB）/p65信号传导通路与Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性的关系。方法 以脂质体为载体,转染2 mg/L的p65反义寡核苷酸于Tca8113细胞 后,8 mg/L的平阳霉素处理细胞,3 h、6 h后免疫组化、Western blot法检测细胞核内p65形态和含量变化,48 h后MTT法检测细胞抑制率。结果 平阳霉素能激活细胞内的NF-κB/p65信号传导通路,而p65反义寡核苷酸转染能明显抑制该信号通路,在6 h时胞核内p65含量显著减少（P<0.05）,48 h时细胞抑制率明显提高（P<0.05）。结论 抑制NF-κB/p65信号传导通路能够提高Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性。     

RNA干扰酪氨酸激酶受体2对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的研究抑制酪氨酸激酶受体2（Tie2）对内皮细胞凋亡和增殖活性的影响。方法采用RNA干扰技术,将含有Tie2基因的特异性短发夹状RNA（shRNA）片段的质粒转染入人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,采用实时定量逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法检测细胞中Tie2 mRNA和蛋白表达的改变;噻唑蓝比色分析（MTT）法检测细胞的生
长情况;显微镜下观察细胞凋亡情况。以转染了pGenesil-hk质粒组为阴性对照,未转染质粒组为空白对照。结果质粒转染入HUVECs后,实验组细胞中Tie2 mRNA和蛋白表达水平较阴性对照组和空白对照组下调,尤以转染后48 h Tie2的mRNA和蛋白表达水平下调更为明显（P<0.05）。MTT检测结果显示：实验组细胞的增殖活性受到明显抑制（P<0.05）。转染48 h后,实验组的细胞凋亡率明显高于两个对照组（P<0.05）。结论RNA干扰技术沉默Tie2基因可致Tie2基因表达下调后诱导HUVECs凋亡,并抑制HUVECs的增殖。     

miR-31-5p对牙髓干细胞HIF-1α/BNIP3信号通路及成骨相关因子表达的影响

目的: 探讨微小RNA-31-5p（miR-31-5p）对牙髓干细胞（DPSCs）低氧诱导因子1α（HIF-1α）/Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3（BNIP3）信号通路及成骨相关因子表达的影响。方法: 体外培养人DPSCs,分为对照组（不转染）、mimic NC组（转染negative control-miR-31-5p）、miR-31-5p mimic组（转染hsa-miR-31-5p mimic）、siRNA NC组（转染nonsense siRNA）和miR-31-5p siRNA组（转染miR-31-5p siRNA）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组DPSCs细胞中miR-31-5p、HIF-1α、BNIP3、碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录子2（Runx2）mRNA的表达情况,MTT法检测各组DPSCs细胞增殖情况,ALP活性测定试剂盒检测各组DPSCs细胞ALP活性,蛋白印迹（WB）法检测各组DPSCs细胞中HIF-1α、BNIP3、Runx2蛋白的表达情况。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组、mimic NC组相比,miR-31-5p mimic组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,ALP染色明显减弱,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与对照组、siRNA NC组相比,miR-31-5p siRNA组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.05）,ALP染色明显增强,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论: miR-31-5p可以激活HIF-1α/BNIP3信号通路,抑制DPSCs细胞的成骨相关因子表达。     

周期性牵张应力作用下KLF5对人牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响

目的: 探讨周期性牵张应力(cyclic tensile stress, CTS) 作用下Kruppel样转录因子5 (Kruppel-like factor 5, KLF5) 在人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cells, hPDLCs) 中的表达及其对 hPDLCs增殖和成骨分化的影响。方法: 酶解组织块法体外培养hPDLCs,对其施加形变率10%,频率0.5 Hz的周期性牵张应力1、4、8、12、24 h,采用RT-PCR 和Western印迹法检测细胞中KLF5 mRNA和蛋白的表达。转染siRNA（si-KLF5）至hPDLCs沉默KLF5表达,RT-PCR检测KLF5 mRNA的表达。同时,将过表达碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF、FGF2）的pcDNA3.1-FGF2转染至稳定转染si-KLF5的hPDLCs,加力8 h 后,以CCK8法检测各组细胞的增殖活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒检测ALP活性,RT-PCR检测成骨分化因子Runx2和Osterix的mRNA表达,Western印迹法检测Runx2、Osterix、FGF2、GSK-3β、P-GSK-3β (ser 9)、β-catenin蛋白的表达。采用SPSS22.0 软件包对数据进行统计学分析。结果: 10% CTS刺激呈时间依赖性地诱导hPDLCs中KLF5 mRNA 和蛋白表达。si-KLF5转染可显著抑制10% CTS诱导的hPDLCs的增殖,降低其ALP活性,减少Runx2和Osterix的mRNA和蛋白表达,并抑制FGF2-GSK-3β/β-catenin信号通路的激活;而过表达FGF2可以部分逆转沉默KLF5对hPDLCs增殖和成骨分化的抑制效应。结论: 周期性牵张应力作用下,KLF5通过FGF2-GSK-3β/ /β-catenin信号通路影响人牙周膜细胞的增殖和成骨分化。