应用微卫星DNA标记探讨我国长江中下游地区湖北钉螺群体遗传结构

目的应用微卫星DNA分子标志分析中国长江中下游地区湖北钉螺群体的遗传结构。方法利用6对微卫星DNA引物,对采集自湖沼型血吸虫病流行区的湖南汉寿县、湖北阳新县、江西星子县、安徽当涂县和江苏扬州邗江区的湖北钉螺的P84、T5-13、T5-11、T4-22、T6-27和P82等6个位点进行荧光标记通用引物PCR扩增。每个采集点采集20～50个钉螺标本,共165个。统计分析各群体的等位基因数(Na)、近交系数(FIS)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)、群体间的遗传分化系数(FST)和遗传距离,根据遗传距离进行聚类分析,并进行分子变异方差分析(AMOVA)。结果 5个湖北钉螺群体在6个微卫星位点等位基因数范围为3～33,平均为15.833。群体的平均He和Ho范围分别为0.600～0.883和0.308～0.759,两者在湖北群体最高,在江苏群体最低。群体的FIS范围为0.143～0.539。成对群体间的FST范围为0.0006～0.0531,由于FST值较小,提示群体间未出现明显遗传分化。各群体的平均PIC为0.511～0.850,除江苏群体外,均为高度多态。分级AMOVA结算结果显示,变异主要存在于个体间,占总变异的95.2%。聚类分析结果显示,安徽群体与江苏群体首先聚为一支,然后依次同湖南、江西、湖北群体聚在一起。结论湖北钉螺多样性较为丰富;聚类分析结果符合湖北钉螺的地理分布格局;5个群体之间遗传差异较小,微卫星DNA的变异主要存在个体间。     

中华白蛉微卫星DNA序列的分离和多态位点筛选的初步研究

目的 分离中华白蛉的微卫星DNA序列,并筛选其中具有多态性的位点。 方法 应用中华白蛉基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针（AAT）₁₇、（GA）₂₅、（CCT）₁₇和（TG）₁₈杂交,亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段,扩增放大后克隆并测序,构建中华白蛉微卫星DNA库。挑选合适的微卫星位点,建立PCR扩增体系。应用中华白蛉现场标本对不同的微卫星DNA进行扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的位点。 结果 本研究分离中华白蛉微卫星DNA的方法效率高,重组克隆阳性率为78.6%。构建的微卫星DNA库含有118条序列,GenBank登录号为FJ919812～FJ919932（登录号为FJ919833、FJ919836和FJ919869除外）,其中典型微卫星DNA序列72条（占61.0%）,非典型序列46条。在构建的中华白蛉微卫星DNA库中选择22个位点进行多态性筛选,电泳结果显示14个为多态位点,双核苷酸重复的位点比三核苷酸和多核苷酸重复位点的多态性高。 结论 首次构建了含有118条序列的中华白蛉微卫星DNA库,共获得14个新的多态微卫星位点。     

微卫星锚定PCR研究湖北钉螺的遗传变异

目的　对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究 ,并为其种及种下分类提供依据。　方法　采用微卫星锚定 PCR(SSR- PCR)技术对中国 7省 15地湖北钉螺基因组 DNA进行 PCR扩增 ,根据扩增产物 ,计算遗传距离(D) ,并构建系统进化树。　结果　各地域标本 PCR扩增产物均呈多态性 ,其中中国大陆与中国台湾湖北钉螺之间的遗传距离为 0 .35 1± 0 .0 4 8(0 .2 6 3～ 0 .4 4 5 ) ;中国大陆湖北钉螺山区型之间的遗传距离为 0 .0 4 3;湖区型之间的遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .2 17;山区型与湖区型之间的遗传距离为 0 .182～ 0 .30 8;来自湖北省境内 9个地域的湖北钉螺 ,其遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .16 7。　结论　根据所采集的湖北钉螺标本和 SSR- PCR的实验结果 ,认为中国大陆湖北钉螺在基因分类水平上至少可分为不同层次的 4类 :1云南洱源、四川天全为一类 ;2安徽贵池、湖南岳阳、湖北荆门、江西新建为一类 ;3湖北武汉、湖北钟祥、湖北阳新、湖北松滋、湖北沙市、湖北石首、湖北应城为一类 ;4湖北赤壁单独为一类。其中 1与 2 34在总体上可分为两大类 ,2 34又可再分为 2 3与 4两类 ,2 3还可再分为单独的两类。此外 ,台湾钉螺为单独的一类。     

基于微卫星标记的不同壳型湖北钉螺小尺度景观群体遗传结构研究

目的 分析湖北松滋地区湖北钉螺小尺度景观群体的遗传结构。方法 选择T6-17、P101、D11、B14、T4-33和C22等6对微卫星位点对松滋地区10个生境的湖北钉螺群体进行基因扫描,计算各群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、 多态信息含量(PIC)、群体间的遗传分化系数(FST)和遗传距离,根据遗传距离进行聚类分析,并进行分子变异方差分析(AMOVA)。结果 10个钉螺群体经鉴定螺壳分为光壳和肋壳(包括浅肋和深肋),10个群体共检测到141个等位基因,各位点20-34个不等,平均每个位点检测到23.5个;6个微卫星位点的平均有效等位基因数为1.575,各位点的有效等位基因数并不平衡,且数值差异较大,范围从0.445至3.060。群体的平均Ho范围为0.438-0.698,在光壳的团山村群体中最低,在深肋型的马木口村群体中最高;群体的平均He范围为0.589-0.892,在浅肋型的德胜村群体中最低,在深肋型的马木口村群体中最高;成对群体间的Fst为-0.01564-0.25247,各群体的PIC为0.528-0.857,显示出高度多态性;AMOVA 分析结果显示,变异主要存在于个体间,占总变异的88.4%;聚类分析结果显示,肋壳的马木口村、横堤村、义兴村三个群体与光壳的马狮子咀村、民主村、土桥村三个群体先聚为一支后,与浅肋的德胜村、木天河村两个群体与光壳的团山村、夹马槽村聚的一支合聚。结论 松滋地区不同景观环境下湖北钉螺呈现不同螺壳形态,尽管遗传多样性较为丰富,但遗传变异主要来自个体间,不同螺壳形态的湖北钉螺群体间并未体现出明显的遗传分化。     

中国大陆不同地区光壳钉螺遗传多样性的RAPD分析

目的 用随机扩增多态性技术(RAPD)对中国大陆5省不同地区的光壳钉螺进行分析，研究光壳钉螺群问的遗传多样性。方法 提取钉螺头足部的基因组DNA，用随机引物进行扩增，扩增产物经8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，0．6％硝酸银染色，判别结果进行分析。结果 9个螺群的平均遗传相似性为0．7214，平均百分匹配数为0．6809，聚类结果表明可分为3个分类群，云南大理和四川普格的钉螺为第一分类群，福建福清和江苏东台的钉螺为第二分类群，安徽的4个螺群和江苏官兴的钉螺为第三分类群。结论 在我国各地的光壳钉螺螺群间存在一定的亲缘关系的同时，已发生了较大的遗传变异，聚类结果中螺群的聚类地位和其地理分布基本上一致，但江苏东台光壳螺群的聚类地位有待进一步分析和研究。     

湖北钉螺种群内AFLP分子标记遗传变异分析

目的 探讨湖北钉螺种群内的遗传变异及其程度。方法 采用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记技术对9省(云南、四川、广西、福建、湖南、湖北、江西、安徽、江苏)13种群湖北钉螺基因组DNA进行扩增,分析钉螺种群内的遗传变异。结果湖北钉螺13种群AFLP扩增片段位点数为403~472,江西星子钉螺种群内遗传多样性较高,多态位点频率、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数分别为93.2%、0.345和0.510,而广西宜州钉螺种群内遗传多样性较低,以上3指标分别为55.8%、0.191和0.287;广西宜州钉螺种群内的相似性较大,相似系数(中位数)为0.904,而江苏丹徒钉螺种群内的相似性较低,相似系数(中位数)为0.748;13种群内的遗传变异差异显著(P<0.01)。结论 我国广泛分布的湖北钉螺,种群内存在一定程度的遗传变异。不同地区湖北钉螺种群内遗传变异程度不同,有的相差较大。     

湖北钉螺基因组5种抽提方法的比较

目的 5种方法提取湖北钉螺基因组DNA,PCR扩增线粒体基因组的COⅡ基因以比较其扩增效果,从而选择适合湖北钉螺大样本基因组抽提的最佳方法。方法将50只钉螺分为5组,每组10只,分别用OMEGA基因组DNA抽提试剂盒、天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、简化基因组抽提方法、CTAB法和饱和酚抽提法抽提单只湖北钉螺基因组DNA,从消化、抽提时间、抽提浓度、成本等方面评价各种方法的优劣;PCR扩增线粒体基因组COⅡ基因,测定目的条带相对浓度以衡量扩增效果。结果 5种方法均能提取基因组DNA,消化时间最短的为饱和酚法,其余均为3 h;抽提时间最短的为两种试剂盒和CTAB,最长的为简化法;抽提成本最高的为OMEGA试剂盒法,最低的为CTAB法。5种方法PCR均扩增出COⅡ基因,但目的条带浓度有一定差异,其中OMEGA公司和天根公司试剂盒及实验室简化法提纯的模板PCR扩增浓度较高。结论用OMEGA公司生产的基因组DNA抽提试剂盒抽提湖北钉螺基因组DNA效果好,但成本较高,适用于对小样本的抽提;简化法从提纯效果、成本等方面评价,较适用于大样本抽提。     

随机扩增多态性DNA技术对我国大陆光壳钉螺遗传多样性的初步探讨

目的探索随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对大陆光亮钉螺遗传多态性研究的可行性,以获得不同地区光壳钉螺基因组DNA水平上的差异信息。方法随机引物对大陆光亮钉螺基因组DNA进行PCR扩增,产物经8％聚丙烯酸胺凝胶电泳、0.6％的硝酸银染色,记录结果并分析。结果 2条引物S15(5’CATGCAGGCG3’)、S18(5’ACAGCCTGCT3’)在螺群间显示出多样性,并且扩增结果稳定可重复。对9个地区钉螺共扩增出82个条带,19.51％的条带为9个地区螺群所共有。S15扩增结果中,云南和四川的螺群在 770bp、390bp处均有特异性条带产生,另外四川在570bp处产生其它螺群均没有的条带。S18的扩增产物中,福建福清的钉螺400bp以下无条带产生。云南和四川的螺群分别在380bp与400bp处产生特异性条带,在750bp处产生共有的特异性条带。而江苏东台和福建福清的钉螺在950bp处产生其他地区的钉螺所没有的特异性条带。这些特异性的条带和特征在同一采集点个体间可以重复。结论RAPD技术可为钉螺的遗传变异分析研究提供分子水平上的信息。我国各地光壳钉螺间存在较大的遗传变异,其变异程度和钉螺采集地的地理分布有一定的关系。     

湖北钉螺细胞原代培养的初步研究

目的研究湖北钉螺组织细胞的原代培养。方法无菌处理并解剖钉螺成螺及螺胚,分别获得软体、肝脏、外套膜及胚胎组织。将软体、肝脏及胚胎组织剪碎,用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)混合液4℃下消化数小时,所得细胞按三宅的湿润系统固定法接种于钉螺的外套膜组织。培养液为1/2浓度的RPMI1640含20％小牛血清附加常量抗生素(青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml),温度为27℃～28℃,pH7.2～7.4。结果钉螺的胚胎组织冷消化后,获大量游离细胞。接种培养5d,见有贴壁细胞,扁平状,多边或不规则形,大小约为(15～20×12～15)μm。培养细胞以悬浮状为主,直径为8～12μm,少数为30～35μm。生长良好,可传代培养。结论钉螺胚胎细胞可进行原代培养及传代。     

湖北钉螺遗传标记研究进展

随着遗传学和分子生物学技术的进步,钉螺遗传标记的发展也经历了由间接到直接、由粗略到精确的过程。本文就钉螺遗传标记的研究进展作一综述。     

对钉螺具有毒性作用细菌的分离及初步鉴定

目的筛选对钉螺具有毒性作用的细菌及其毒素成分.方法收集濒死钉螺及其周围的土壤样本,分离其中的细菌.经发酵制备细菌的发酵上清、细菌裂解产物.通过杀螺毒性试验测定细菌发酵上清液、细菌的裂解产物及细菌对钉螺的毒性作用.结果从濒死钉螺及土壤样本中分离到104株细菌,经初步鉴定,这些细菌包括革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌,革兰氏阴性球菌、革兰氏阴性杆菌.细菌PY1-1, PY3-3, PY1-2-1, PY7-2, PY3-5, PY19-3, PY2-2-2, PY8-2-2, PY8-4, PY16-1的发酵上清液、细菌裂解产物及细菌菌体对钉螺均具有不同程度的毒性作用,其中细菌PY1-1, PY7-2, PY3-5, PY19-3, PY2-2-2, PY8-2-2, PY16-1的发酵上清液对钉螺的杀灭作用均〉50.0%.结论对钉螺具有毒性作用的细菌已经被分离出,为进一步鉴定对钉螺具有毒性作用的单一细菌成分奠定了基础.     

湖北钉螺酚氧化酶的部分纯化及酶学特征

目的制备并纯化钉螺酚氧化酶,探讨该酶最适pH、最适温度及其底物专一性等特征。方法利用匀浆、离心等方法制备粗制酚氧化酶酶液,用盐析、凝胶层析进行酶液纯化;在不同pH、不同温度下测定该酶比活力,寻求最适pH、最适温度;根据测定不同底物(邻苯二酚、L-多巴、焦没食子酸)对该酶的酶促反应米氏常数(Km),判定其底物专一性。结果经纯化后酶活力提高了13.62倍。该酶对邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的Km值分别为5.66±0.84mmol/L、4.72±0.45mmol/L和20.64±2.36mmol/L(前两者比较P>0.05,分别与后者比较P均小于0.05)。酚氧化酶在pH6.0、40℃时活性最高。结论通过盐析、凝胶过滤层析等方法纯化可使酶活性明显提高;钉螺酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力近似于L-多巴,两者均高于对焦性没食子酸的亲和力。     

湖北钉螺交配行为及方式的观察

目的研究钉螺的交配行为及交配方式。方法将5~6旋活力较强的成熟钉螺放入培养皿中,置于奥林巴斯体视解剖镜下观察,记录全部交配过程。结果钉螺的交配行为可分为觅偶和求偶2个阶段;交配方式可分为2种基本形式4种类型。结论成功利用显微摄像系统详细观察了钉螺的交配行为及交配方式,提出了交配体位和朝向的划分模式,以资在钉螺和其他动物交配和行为模式的准确描述中提供参考和借鉴。     

湿地保护和钉螺控制

湿地是地球上水陆相互作用形成的独特生态系统。当前湿地生态和湿地保护日益受到重视, 而传播日本血吸虫 病唯一的螺宿主——钉螺也是一种湿地生物。在血吸虫病防治中通常采用化学药物和改变生态环境的措施实现控制钉 螺, 而这些措施对湿地生态存在不同程度的影响。为了适应湿地保护要求, 加强湿地钉螺控制适宜技术研究, 本文重点阐 述不同类型湿地对钉螺孳生的影响, 以及钉螺控制措施对湿地生态的影响, 讨论湿地钉螺控制对策。     

两种方法饲养湖北钉螺的对比观察

目的 对比两种人工饲养湖北钉螺方法,建立实验室钉螺饲养的最佳方法。方法 保持实验室温度、湿度、光照等条件一致,采用泥钵饲养法和搪瓷盘草纸饲养法,对湖北钉螺进行平行饲养观察,统计各自钉螺死亡率。结果泥钵饲养法钉螺的累计死亡率为19.08%,月平均死亡率为9.75%;搪瓷盘草纸饲养法钉螺的累计死亡率为30.08%,月平均死亡率14.28%。两种饲养方法钉螺死亡率的差异有统计学意义（P<0.01）。结论 泥钵法饲养钉螺在提高钉螺存活率方面具有一定优势,但此法操作较为繁琐,大规模饲养时劳动量大,有待作进一步改进。     

景观遗传学及其在湖北钉螺研究中的应用

景观遗传学是一门新兴的交叉学科,该学科的发展为湖北钉螺分子系统地理学和群体遗传分化研究提供了新的研究手段。本文介绍了景观遗传学的产生、概念、研究方法和应用领域,系统分析了景观遗传学研究方法在湖北钉螺分子系统地理学和群体遗传分化研究中的应用进展,阐述了空间分布格局与湖北钉螺遗传分化与变异的相互作用,为湖北钉螺种群遗传学研究提出了新的思路。     

钉螺软体组织蛋白水解酶的初步分析

目的分析钉螺软体组织中的蛋白水解酶。方法以明胶作底物,利用明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离钉螺软体组织蛋白质,于不同缓冲液和酶抑制剂中进行孵育,分析和鉴定其中的蛋白水解酶。结果钉螺软体组织中存在降解明胶的蛋白水解酶,其最适pH值为碱性。金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)可抑制其活性。电泳分离获得有活性的酶蛋白。结论钉螺软体组织中存在被EDTA抑制的蛋白水解酶。