HBV及HCV基因免疫研究现状

基因免疫也称核酸疫苗，开辟了新的基因免疫治疗途径，被喻为第三疫苗革命。国外正广泛开展关于病毒，肿瘤及寄生虫感染的基因免疫实验研究。本文就ＨＢＶ及ＨＣＶ基因免疫研究现状作一概述。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中．通过RT—PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3．1^（＋）或pcDNA3．1^（-）真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363 bp相符;重组pGEM—T被EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3．1^（＋）和pcDNA3．1^（-）测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

乙型肝炎病毒X基因载体的构建及鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因高效真核表达载体,为进一步研究乙型肝炎病毒X基因的功能及乙型肝炎病毒母婴垂直传播的可能机制奠定基础.方法 设计并合成乙型肝炎病毒X基因的引物,以我国急性肝炎患者血清中获得的全长乙型肝炎病毒序列C基因型作为构建载体X基因序列的母板进行扩增,将扩增产物X基因连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等鉴定所构建的真核表达载体.结果 以重组载体为模板、用乙型肝炎病毒X基因引物PCR扩增得到的目的 片段为500bp,与已知乙型肝炎病毒X基因大小相同,酶切后发现在500bp左右及5kb左右出现两条特异性条带,分别与已知X基因序列相同.结论 成功构建了乙型肝炎病毒X基因真核表达载体,为进一步研究乙型肝炎病毒X基因的功能及宫内感染的可能机制奠定了基础.     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

沙眼衣原体ompA基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达

目的　构建沙眼衣原体 (Ct)ompA基因真核表达重组质粒 ,利用脂质体体外转染HeLa细胞 ,为核酸疫苗的研制作准备。　方法　应用PCR技术从D型Ct基因组中扩增ompA全长基因 ,重组入 pUCm -T克隆载体。将pUCm -T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应 ,亚克隆入 pcDNA3 .1真核表达载体的相应位点 ,进行序列分析和酶切鉴定后 ,运用脂质体将重组体 pcDNA3 .1/ompA转染HeLa细胞 ,免疫组化法观察目的基因的表达。　 结果　PCR扩增得到约 1.2kb的特异性ompA基因片段 ;序列测定证实与发布序列一致 ;构建得到真核表达重组体 ;重组质粒pcDNA3 .1/ompA在HeLa表达MOMP。　结论　CtompA基因能够在体外真核细胞中表达 ,为进一步研究CtDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

原发性肝癌与HBV及HCV感染关系的探讨

本文观察原发性肝癌（ＨＣＣ）、肝硬化、慢性肝炎及肝脏良性占位性病变等患者血清ＨＢｓＡｇ及抗ＨＣＶ的检测结果。探讨ＨＣＣ与ＨＢＶ及ＨＣＶ感染之间的关系，结果显示，１０６例ＨＣＣ病人中，９６例血清ＨＢｓＡｇ阳性（占９０．６％）；１１例抗ＨＣＶ阳性（占１０．４％）；ＨＢｓＡｇ与抗ＨＣＶ均阳性者７例（占６．６％），表明ＨＢＶ感染与ＨＣＣ的发生关系密切；抗ＨＣＶ阳性率（１０．４％）低于日本及欧美报道的结果（６５～９０％），提示在我国ＨＣＶ感染与ＨＣＣ的关系远不如ＨＢＶ感染与ＨＣＣ的关系密切。     

HBVX基因真核细胞载体的构建

目的 为了探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系，构建含X基因的真核表达质粒。方法 用PCR方法扩增含EcoRI和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对Puc118载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌JM109，称PUC118-HBx，再将PUC118-I-IBx与PCDNA3．1( )双酶切，将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，称PCDNA3．1( )-HBx，并对其进行序列测定。结果 已构建PCDNA3．1( )-HBx载体，经序列测定含有完整的X基因片段。结论 PCDNA3．1( )-HBx表达载体可为了解X基因与X蛋白对慢性乙型肝炎及肝癌发生的作用，为X基因与X蛋白的生物学功能研究提供可靠基因材料。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

新型呼肠病毒S1基因的表达鉴定

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在大肠杆菌中的表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western-blot的检测结果一致表明,诱导后1~5 h均可检测到目的蛋白的表达,其中以5 h的蛋白表达量最大,且表达的目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在。结论通过构建重组原核表达质粒,可使目的蛋白σ1得到诱导表达,为后续抗体制备及研究病毒-宿主相互作用提供实验基础。     

miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。