人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a( ),获得pET28a( )-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.     

人乳头瘤病毒11型L1/CD80嵌合真核表达质粒的构建和鉴定

生殖道尖锐湿疣主要是由人乳头瘤病毒6型(HPV6)和11型(HPV11)感染引起。HPV病毒仅存在终末分化的复层鳞状上皮组织中，含量很少。HPV病毒的晚期表达基因L1所表达的外壳蛋白不仅是主要的外壳蛋白，还是主要的病毒抗原蛋白，在宿主细胞表面有其蛋白受体，可成为预防性疫苗最理想的靶抗原。我们构建了含有完整的HPV11型L1基因的真核表达质粒，为增强其作为治疗性疫苗的免疫效果，并进一步将HPV11L1基因和共刺激分子CD80进行连接重组，构建HPV11 L17／CD80嵌合基因的DNA疫苗，为下一步研究其免疫原性提供试验数据。     

人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将c57BL／6小鼠,随机分为4组：Ⅰ组：pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组：pcDNA—L1(70μl/鼠) HPV16K1 VLP,Ⅲ组：pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组：PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1 HPV16L1 VLP较pcDNA—L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA—L1 HPV16L1 VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA—L1免疫组,且．He[a细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1 VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。     

人乳头状瘤病毒16型不同基因疫苗联合免疫的实验研究

目的 探索联合免疫策略在预防和治疗人乳头状瘤病毒16型（HPV16）相关肿瘤中的作用。方法 在C57BL／6动物模型中，观察了表达HPV16基因的融合蛋白L2E7疫苗和重组痘苗病毒mE67疫苗的不同联合免疫方式在预防和治疗HPV16相关肿瘤中的作用。用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应评价它们在诱发机体产生细胞免疫应答中的作用。结果 我们发现以HPV16 L2E7融合蛋白＋佐剂（CpG）初免，用重组痘苗病毒rVVmE67加强免疫的联合免疫方式在C57BL／6小鼠实验中可以有效预防和治疗HPV16相关肿瘤的攻击。ELISPOT可以检测到高水平的E749-57肽特异性，分泌IFN-γ的效应T细胞。CTL检测同样反应出这种联合免疫方式所诱发的CTL细胞可以有效识别并杀伤含HPV16E6／E7的靶细胞。结论 以HPV16L2E7融合蛋白＋CpG初免，用重组痘苗病毒rVVmE67加强的联合免疫策略可以有效防治HPV16相关肿瘤，为进一步研究提供了科学基础。     

滴鼻接种HPV16 L1-E7 DNA初始引发及HPV16 L1 VLP强化免疫可增强小鼠黏膜和细胞免疫

目的探讨HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16L1病毒样颗粒(VLP)强化接种小鼠诱发免疫反应的效应,为进一步用于HPV16相关恶性肿瘤的防治提供实验依据。方法以HPV16 L1-E7嵌合蛋白、HPV16 L1 VLP以及HPV16 L1-E7 DNA单独或联合滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,连续使用3周。免疫后采血及收集阴道分泌物,检测特异性抗体。在末次免疫2周后,取小鼠脾细胞,用HPV 16 L1-E7蛋白刺激,检测T细胞增殖反应及IFN-γ水平。结果HPV16 L1-E7嵌合蛋白滴鼻接种可诱导小鼠产生血清HPV16 L1特异性IgG,强化免疫后抗体水平明显增高(P<0.01);阴道局部产生HPV16 L1特异性IgA;在HPV16 L1-E7抗原刺激下,脾细胞上清液中IFN-γ水平升高。HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发和HPV16 L1蛋白加强免疫可增高阴道分泌液中HPV16 L1特异性IgA水平,增高脾淋巴细胞中特异性T细胞产生IFN-γ的水平。结论嵌合病毒样颗粒HPV16 L1-E7和HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16 L1蛋白强化滴鼻接种适用于预防HPV原发性黏膜感染和治疗HPV16相关肿瘤。     

人乳头状瘤病毒DNA疫苗

人乳头瘤病毒 (HPV) ,尤其是HPV1 6型 ,是子宫颈癌的主要病原体。因此 ,通过引起病人适当的病毒特异性免疫反应可以预防或治疗HPV相关的子宫颈恶性肿瘤。在已经进行预防接种的个体中 ,包括L1和L2在内的HPV衣壳蛋白已经显示出能够产生对抗HPV颗粒抗体的抑制。此外 ,HPV致瘤性蛋白 ,例如E6蛋白和E7蛋白 ,在细胞转换的导入和维持方面是很重要的 ,在大多数包含HPV的癌症中它们也是共同表达的。它们为产生抗HPV感染和HPV相关肿瘤形成的治疗量的疫苗提供了理想的靶。针对这些蛋白的疫苗可能提供一个控制HPV相关恶性肿瘤的机会。拥有…     

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。     

表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究

目的研究表达HPV—16结构蛋白L1和12的重组痘苗病毒（rVVL1L2）的免疫效果。方法以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BIJ6小鼠，用酶联免疫（ELISA）和酶联免疫斑点（ELISPOT）方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平；利用C3肿瘤细胞在C57BIJ6小鼠中的成瘤模型，观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果。结果重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠，可以检测到针对L1和12特异的抗体、L1165-175肽特异性的、分泌IFN-的T细胞；同时可以观察到免疫后的C57BI/6小鼠，可以有效预防HPV．16相关肿瘤细胞（1．5×10^5C3细胞）的攻击；对已产生的肿瘤，可以延缓肿瘤细胞的生长速度。结论重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料。     

HPV主要壳蛋白L1的B细胞共同表位短肽免疫原性的研究

人乳头瘤病毒 (humanpapillomavirus ,HPV)是一类无包膜的环状小DNA病毒 ,可引起广泛的人类上皮细胞的增殖性病变。为了有效预防这类病毒的感染和传播 ,世界各国都在开展大量HPV基因工程疫苗的研究。广泛研究证实 ,HPV主要壳蛋白L1和次要壳蛋白L2存在中和表位。L1具备在单独表达体系中自行装配、形成病毒样颗粒 ,在一定程度上能够替代天然病毒 ,诱导产生针对天然病毒的保护性抗体。但是L1蛋白分子量较大 ,表达成本高 ,且型特异性强 ,以任意一型HPVL1免疫动物 ,很难诱导出针对多型的免疫反应。因此 ,必须寻找到HPVL1的共同表位 ,以…     

16型人乳头瘤病毒（HPV16）中和表位及型内变异分析北大核心CSCD

世界范围内,宫颈癌是妇女第二位高发肿瘤.高危型人乳头瘤病毒（human papilloma-virus,HPV）持续感染是引发宫颈癌的主要原因,在所有高危型HPV中,HPV16流行最广泛.HPV主要衣壳蛋白（major capsid protein,L1）可以自组装成病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）,其形态及抗原性与天然病毒类似,可以刺激机体产生高效价保护性中和抗体.中和表位是HPV VLPs疫苗的结构基础,疫苗的效力主要取决于中和表位的完整性.目前基于中和单抗的HPV16表位研究取得了极大进展.随着免疫压力的增加,HPV16的型内变异株越来越多.1204条HPV16 L1氨基酸序列构建的进化树可以分为4个进化分支.同时,将其与114K参考序列相比,共挑选出8个＂高频突变位点＂,6个＂特有突变位点＂和20个＂表位相关位点＂.HPV诱导的中和抗体绝大多数都是型特异性的,但同一型别内的HPV所诱导的中和抗体对型别内的所有L1变异株是否都能保护尚无定论.剖析HPV16型的抗原表位及型内变异情况对设计高效价、高覆盖率的预防性疫苗至关重要.