重组腺病毒Ad-ES对人脐静脉内皮细胞的体外抑制作用

目的 构建携带人内皮抑素(ES)的重组腺病毒Ad-ES,体外感染人脐静脉内皮细胞ECV-304,观察抑制作用.方法 以Pshuttle-ES质粒为模板PCR扩增ES基因片断,利用AdEasy-1系统及AAV293细胞构建并包装出Ad-ES,感染ECV-304细胞,病毒感染48 h后,Western blot检测ES蛋白表达,流式细胞术及DNA ladder检测ECV-304细胞凋亡情况,绘制细胞生长曲线.结果 ECV-304细胞在感染Ad-ES后生长受到抑制,感染3 d后出现细胞凋亡.结论 重组腺病毒Ad-ES在体外可抑制ECV-304细胞的生长并诱导其凋亡.     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物靶向抗肿瘤治疗研究

目的 探讨阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒(lipo+Ad-hEndo)复合物的抗肿瘤效果.方法 制备阳离子脂质体(lipo)、重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)及两者复合物,建立BALB/c裸鼠卵巢癌动物肿瘤模型,并将荷瘤裸鼠随机分为6组:生理盐水组、lipo组、lipo+腺病毒空载体(Ad-null)组、Ad-hEndo、lip+Ad-hEndo高剂量治疗组和低剂量治疗组.每7 d测量各组荷瘤裸鼠肿瘤体积,49 d后处死各组裸鼠剥取肿瘤称重,并将肿瘤组织进行调亡细胞计数及微血管密度检测.体外试验观察腺病毒中和抗体对阳离子脂质体-腺病毒复合物的作用.结果 lip+Ad-hEndo高、低剂量治疗组的瘤重抑制率分别为54.74%,70.65%,与其它各组比较差异有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学及TUNEL观察到:两治疗组裸鼠肿瘤组织中,凋亡细胞增多,微血管数减少,与其它组比较差异有统计学意义(P<0.05).体外中和抗体荧光结果 显示:加腺病毒中和抗体的腺病毒感染细胞与未加中和抗体的腺病毒感染细胞比较,前者荧光表达数仅为后者的18.13%;而加腺病毒中和抗体的脂质体-腺病毒组感染细胞与未加中和抗体的脂质体-腺病毒感染细胞比较,前者荧光表达数达后者的70.09%.结论 在人卵巢癌动物模型中,lip+Ad-hEndo能有效抑制肿瘤的生长,且低剂量组的抑瘤效果好,阳离子脂质体可以有效地保护腺病毒不被中和抗体作用,仍然维持其感染活性,为重复注射腺病毒制剂而避免被抗体中和降低药效提供理论基础.     

重组人内皮抑素腺病毒对裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用

目的 探讨重组人内皮抑素腺病毒(Ad-endo)对人胰腺癌移植瘤生长的影响.方法 人胰腺癌Capan-2细胞经Ad-endo感染后,PT-PCR方法检测人内皮抑索基因的表达.收集Ad-endo感染Capan-2细胞的条件培养液,观察其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外增殖的影响.建立人胰腺癌Capan-2细胞移植瘤模型,观察Ad-endo对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用,分析肿瘤内微血管密度的变化情况.结果 RT-PCR方法检测到人内皮抑素基因在Capan-2细胞的表达,Ad-endo感染Capan-2细胞的条件培养液能明显抑制HUVEC的增殖.Ad-endo显著减缓了人胰腺癌Capan-2细胞移植瘤生长(P<0.05),同时也明显减少了肿瘤组织微血管密度(P<0,05).结论 腺病毒介导的人内皮抑素基因能明显抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长与血管生成.     

抗血管生成抑制裸鼠异位子宫内膜的生长

目的:研究抗血管生成对裸鼠异位子宫内膜病灶的抑制作用?方法:利用腺病毒AdEasy-1系统及AAV293细胞构建携带内皮抑素(ES)基因的重组腺病毒Ad-ES,体外感染脐静脉内皮细胞ECV-304,诱导其凋亡;建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型,将Ad-ES?空载腺病毒Ad-Track及生理盐水分别注射至裸鼠皮下病灶,观察病灶的形态学特点,检测微血管密度(MVD),TUNEL法检测血管内皮细胞及腺细胞凋亡?结果:Ad-ES经测序?PCR鉴定构建成功,滴度为2.06×1010 pfu/ml;ECV-304感染Ad-ES后,流式细胞术及Hoechest 33258染色均检测到细胞凋亡;成功建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型,Ad-ES治疗组病灶体积较其他两组明显缩小(P < 0.05),HE染色后,光镜下可见腺体萎缩明显,部分结构不完整,间质伴有不同程度的坏死,TUNEL法检测到细胞凋亡明显增加,MVD减少?结论:内皮抑素可诱导血管内皮细胞凋亡?抗血管生成,并可抑制裸鼠异位子宫内膜病灶的生长,抗血管生成可能作为治疗子宫内膜异位症的方法?     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长的抑制

目的在一种高效外源基因表达系统———毕赤酵母系统表达重组人内皮抑素,评价纯化的内皮抑素对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长抑制的作用,为临床研究做进一步的探讨。方法和结果在酵母系统成功表达了重组人内皮抑素(re-combinant human endostatin),经肝素亲和层析得到了较高纯度的内皮抑素,经过筛选的人内皮抑素能够有效抑制ECV-304细胞的增殖,并与对照组有非常显著性差异(P<0.01);动物实验表明其能够有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1细胞的生长,统计学分析有非常显著性差异(P<0.01)。结论酵母系统内能够大量表达具有生物学活性的重组人内皮抑素,能在人体外有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1的生长,对其应用于临床具有重要意义。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

目的 构建携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒rAAV-hEndo,介导其体外表达并检测其生物活性。方法 采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-hEndo,测定其滴度及感染效率。免疫荧光染色检测内皮抑素蛋白在体外感染细胞中的表达,并通过MTT法、细胞周期检测及TUNEL法检测细胞凋亡指数,观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响。结果 所制备的重组腺相关病毒滴度为2×10¹²vg/ml,感染效率达98%。免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞胞质。rAAV-hEndo感染细胞培养上清对ECV304细胞72h增殖抑制率为67.3%。内皮细胞转染内皮抑素基因后细胞周期明显阻滞于G₁期,其G₁期占(72.5±4.0)%,与对照组(52.1±2.1)%比较有显著差异(P<0.01)。TUNEL法检测实验组内皮细胞凋亡指数为(32.6±3.2)%,与对照组(4.2±1.9)%比较有显著差异(P<0.01)。结论 所制备的重组腺相关病毒rAAV-hEndo能有效介导具有生物活性的内皮抑素表达,为进一步肿瘤抗血管生成基因治疗动物实验奠定了基础。     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

人乳头瘤病毒在人大肠癌中检出

用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)法对28例大肠癌(均为分化程度不同的腺癌)及18例相应癌旁组织中人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16和18型DNA分别进行检测。在28例大肠癌组织中分别检测到3例(10.8％)呈HPV16DNA阳性和18例(64.5％)呈HPV18DNA阳性。而相应的18例癌旁组织中仅检测到3例(16.7％)呈HPV18DNA阳性,未检测到HPV16DNA。为了证实扩增产物的特异性,我们用限制性内切酶对PCR产物分别进行了酶切分析,结果与预期的完全相符。本文提示HPV感染可能是大肠癌的发病因素之一。     

赖氨酰氧化酶样基因3在人皮肤成纤维细胞株中的表达

目的研究体外培养的人皮肤成纤维细胞株中赖氨酰氧化酶样基因3（lysyloxidase-likegene3,LOXL3）的表达模式。方法提取不同生长阶段的人皮肤成纤维细胞株的不同组分,用NorthernBlot和WesternBlot分别从mRNA和蛋白水平分析LOXL3表达,并以免疫荧光方法观察LOXL3的分布部位。结果 LOXL3mR-NA和蛋白含量在细胞汇合前低于细胞汇合期,汇合后最高,且LOXL3分布在整个细胞浆和细胞核。结论 LOXL3的表达量在细胞生长的不同阶段有所不同,可能与其功能有关。     

健全人才管理机制 提升人力资源价值

本案例描述了某省人民医院在医院发展过程中出现的问题,表面上看是医院职工在工作中出现的跳槽现象,其实是在相当多的医院中均存在的医院人事管理工作中的问题,即如何用好人才、留住人才的问题。