转染慢性粒细胞白血病总RNA对树突状细胞介导的抗白血病作用的体外研究

目的体外诱导和鉴定慢性粒细胞白血病-树突状细胞（CML—DC）,并探讨人慢性粒细胞白血病（CML）总RNA体外转染对其介导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLl对慢性粒细胞白血病细胞杀伤作用的影响。方法分离14例CML患者骨髓单个核细胞．加入rhIL-4、rhGbl—CSF、rhTNF-α诱导培养CML—DC。分别于培养第1、3、6、14d用倒置显微镜进行形态学观察．流式细胞术检测免疫学表型,染色体G显带技术检测其染色体核型,逆转录聚合酶链反应（RT—PCRIl检测bcr—abl融合基因。并于CML-DC培养第5d,加人CML细胞总RNA脂质体转染,或裸总RNA转染,或不加任何试剂继续培养的DC,共三种CML—DC．分别致敏T淋巴细胞．另设以IL-2培养的T淋巴细胞为对照组,比较不同组别的致敏T淋巴细胞的杀伤活性。结果CML骨髓单个核细胞诱导前CDlct、CD83表达均在5％以下。而诱导成熟的CML—DC细胞CDla、CD83阳性表达率分别为20．13~3．43％、26．76＋2．79％,较诱导前均明显增高（P〈0．01）。CML-DC细胞均存在Phl染色体,并表达bcr-abl融合基因。总RNA脂质体转染CML—DC、裸总RNA转染CML—DC、单纯CML—DC分别致敏的T淋巴细胞在效：靶比为20：1时对CML单个核细胞的杀伤效率分别为75．33±3．11％、37．23±2．92％、29．62±1．61％,均明显高于对照组f9．87＋3．43％,P〈0．01）。总RNA脂质体转染的CML—DC所诱导的CTL杀伤活性最强．与后三组杀伤活性均有显著性差异（P〈0．001）。结论CML—DC既具有CML白血病源性．又具有DC细胞的特性,并能诱导特异性CTL杀伤白血病细胞。经脂质体转染CML细胞总RNA可以提高CML-DC介导的CTL特异性杀伤慢性粒细胞白血病细胞。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞对特异性抗白血病T细胞的作用

树突状细胞（ＤＣ）是有效的抗原呈递细胞,我们从初诊慢性粒细胞白血病慢性期（ＣＭＬＣＰ）患者的外周血中培养出ＤＣ,探讨其对特异性抗白血病Ｔ细胞（ＡｎｔｉＬＢＴ）的作用。病例和方法１　病例　初诊ＣＭＬＣＰ患者１６例。均有ｔ（９;２２）染色体异常。其中男１０例,女６例。年龄３２（１８～４５）岁。分别将与其中６例患者ＨＬＡ相合的６名健康亲属作为正常对照。２　单个核细胞（ＭＮＣ）的分离制备　取肝素抗凝的外周血或骨髓２～３ｍｌ,按文献［１］分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）或骨髓单个核细胞（ＢＭＭＮ…     

自体树突状细胞活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病细胞毒性作用研究

目的 考察自体树突状细胞（DC）活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病（CGL）细胞的毒性作用。方法 用免疫磁珠从2例缓解的CGL患者骨髓单个核细胞（BMMNC）分离DC,另取BMMNC分成3份,分别加入长期培养基,建立Dexter培养体系。第1份为对照,第2份加重组人白细胞介素2（rhIL-2),第3份于培养第4天加入收获的DC,培养10d后收集非贴壁细胞。以上述3份非贴壁细胞为效应细胞,对照非贴壁细胞为靶细胞,采用双色流式细胞技术进行细胞毒性实验,同时用流式细胞技术检测BMMNC的P210表达。结果 DC活化的效应细胞比rhIL-2活化的效应细胞对靶细胞有更大的杀伤作用,靶细胞中的死细胞比例例1分别为63．12％和42．59％,例2分别为61．60％和21．46％。另外,DC活化的效应细胞与靶细胞混合孵育后,效应细胞本身的死细胞比例明显增加,rhIL-2活化的效应细胞无此现象。BMMNC经培养后非贴壁细胞中P210阳性细胞比例明显减少,以含DC者最为显著,含rhIL-2者次之。结论 自体DC活化的骨髓细胞能对CGL细胞产生明显的细胞毒性作用,DC的作用胜过rhIL-2。这些经DC活化的骨髓回输后可能在体内发挥移植物抗白血病（GVL）效应。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的功能研究

为研究慢性髓性白血病（ＣＭＬ）来源的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ,ＤＣ）的功能,将ＣＭＬ骨髓和外周血单个核细胞在含ＧＭ－ＣＳＦ,ＩＬ－４,ＴＮＦ－α的培养基中培养７－１４天。利用流式细胞术对培养细胞进行表型鉴定,通过ＦＩＴＣ－ＤＸ（ＦＩＴＣ标记的葡聚糖）摄入实验,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和ＭＴＴ实验,以及ＬＤＨ释放试验,分别检测不成熟ＤＣ对外源抗原的摄入能力,成熟ＤＣ对外源和内源抗原的呈递能     

自体树突状细胞活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病骨髓的净化

为考察慢性粒细胞白血病(CML)患者自体树突状细胞(DCs)活化骨髓细胞、净化骨髓的作用,采用免疫磁珠从2例血液学缓解的CML骨髓单个核细胞(BMMNCs)分离DCs,另取BMMNCs置T-25塑料培养瓶建立Dexter培养体系,分为3份,第1份为对照,第2份加rhIL-2,第3份加自体DCs.每周取半量非贴壁细胞、计数、行CFU-GM检测,然后加等量新鲜培养基继续培养.当非贴壁细胞总数＜2×105时终止培养,收集贴壁细胞做CFU-GM集落形成试验并检测CD34和P210表达.取贴壁细胞形成的CFU-GM集落,抽提RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BCR/ABL的表达.结果发现,在DCs加入CML骨髓Dexter培养体系培养后1-2周,非贴壁细胞的CFU-GM产量明显下降,与rhIL-2的体系基本平行,同时体系中的P210阳性细胞显著减少.不过,培养3周后含DCs的体系CFU-GM产量下降减缓,而含rh-IL-2的体系CFU-GM产量持续下降.在含自体DCs的Dexter体系,贴壁细胞中CD34+细胞和P210+细胞比例最低,只是贴壁细胞产生的CFU-GM集落中,BCR/ABL(+)的集落比例与不合DCs的体系比较无明显差别.这些结果说明自体DCs加入CML骨髓Dexter培养体系能减少白血病的祖细胞,包括成熟的祖细胞和原始的祖细胞,自体DCs有可能用于CML骨髓的体外净化.     

三氧化二砷增强STI571诱导的慢性粒细胞白血病细胞凋亡

目的 探讨三氧化二砷(Arsenic Trioxide，AID)对STI571诱导慢性粒细胞白血病细胞系F210ber／abl( )K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 以ATO和STI571不同浓度组合孵育细胞，观察细胞增殖活力、集落形成和细胞形态学；流式细胞仪(FCM)测定细胞凋亡率和细胞周期；RT-PCR半定量观察Bel-XL及ber／abl转录本的表达；并检测凋亡进程中胞浆细胞色素c(eyt c)、半胱氨酸蛋白酶3(easpase-3)蛋白的表达。结果 ATO和STI571均可诱导K562细胞凋亡，两药物联用时，ATO可增加STI571诱导细胞发生凋亡的比例；凋亡进程中，K562细胞胞浆部分eyt c蛋白增多，easpase-3活性增强；RT-PCR结果显示，STI571和AID于12h均可下调Bel-XL转录本的表达，联用时进行性下调作用明显；STI571于96h明显下调k／abl转录本表达，但AID对ber／abl转录本无影响，两药物联用时72h即可见明显下调作用。结论 AID可增强STI571对K562细胞的诱导凋亡作用，其机制与线粒体下游的CytC胞浆转位和Caspase-3激活的信号通路相关，同时两药物也通过调节Bel-XL及bet／abl基因以促进K562细胞凋亡。     

从一例慢性嗜酸性粒细胞白血病发现克隆性增殖T淋巴细胞

利用TCRβV基因指纹图谱分析1例慢性嗜酸粒细胞白血病(CEL)患者的外周血T细胞克隆变化，了解与CEL疾病相关的T细胞受体(TCR)β可变区主要接触抗原的CDR3序列特征。用RT—PCR扩增CEL患者的外周血TCRβV1—24个家族的基因序列，在变性测序胶上电泳，形成TCRβV基因指纹图谱，切割克隆性增生的电泳条带进行测序分析。结果显示：TCRβV基因指纹图谱在βVl3．2家族中的分子量较小处出现一条明显扩增的条带，切割此条带并测序证实为单克隆性T细胞增殖，其CDR3的氨基酸序列为：SFSYEQY，其中SFSY基序为特异性保守序列，其它家族无异常改变。结论：该CEL患者TCRβVl3.2家族中出现了单克隆性增殖的T淋巴细胞群，可能是针对CEL恶性肿瘤细胞反应性增生的T细胞克隆。     

T淋巴细胞识别自体慢性粒细胞白血病肿瘤细胞抗原的研究

目的：验证慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者体内是否存在细胞毒Ｔ淋巴细胞前体细胞，并鉴定其表型和功能特征。方法：用混合淋巴瘤细胞培养技术，用自体瘤细胞和细胞因子刺激扩增ＣＭＬ患者骨髓和外周血单个核细胞（ＭＮＣ）。结果：ＣＭＬ缓解期和慢性期均存在对自体和异体ＣＭＬ细胞杀伤活性的Ｔ淋巴细胞，这些细胞对自体和异体正常ＭＮＣ没有杀伤活性，对正常ＣＦＵ－ＧＭ无抑制作用。而ＬＡＫ细胞对自体ＣＭＬ细胞无杀伤活性（＜１０％），只对异体ＣＭＬ细胞有杀伤活性。上述Ｔ细胞包括ＣＤ３＋ＣＤ５６＋非主要组织相容性抗原（ＭＨＣ）限制性Ｔ细胞，和ＣＤ３＋ＣＤ６－ＭＨＣ限制性Ｔ细胞。用自体ＣＭＬ细胞刺激可增加Ｔ细胞激活抗原ＣＤ２５和ＨＬＡ－ＤＲ的表达。上述Ｔ细胞对自体ＣＭＬ细胞呈较弱的增殖反应，对异体ＣＭＬ细胞几乎无增殖反应，对载有ＢＣＲ－ＡＢＬ肽的自体缓解期ＥＢ病毒转染Ｂ细胞也无增殖反应。结论：ＣＭＬ细胞可能有共同的肿瘤抗原，后者可以被Ｔ细胞识别，但尚无证据表明是ｐ２１０的融合区序列。     

慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增

本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34 细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病 免疫功能。从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34 细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养。 首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产 生:同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照。获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分 析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细 胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34 细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34 细 胞总数扩增77±5倍。用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)％,细胞扩增倍数及 DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P<0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML 细胞。结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱 导产生抗白血病免疫反应。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

雷帕霉素对慢性髓性白血病细胞增殖的抑制作用及其机制

目的 探讨雷帕霉素对慢性髓性白血病(CML)细胞增殖的抑制作用及可能机制.方法 用不同浓度雷帕霉素处理CML细胞系K562细胞,用MTT法检测雷帕霉素对K562细胞的增殖抑制率;Western blot法及RT-PCR法检测不同浓度雷帕霉素作用后的K562细胞中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白及mRNA表达水平,Western blot法检测CML慢性期患者骨髓原代细胞中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白及磷酸化水平,并以健康人骨髓细胞为对照;数据采用x2检验、Fisher确切概率计算、单因素方差分析(ANOVA)方法进行分析.结果 CML慢性期患者骨髓中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白磷酸化水平与正常对照相比明显增高(70.6％对30.0％,76.5％对40.0％,73.5％对20.0％,P值均＜0.05);20 nmol/L及更高浓度雷帕霉素对K562细胞增殖有明显抑制作用;雷帕霉素作用可降低K562细胞中mTOR磷酸化水平,及4E-BP1、p70S6K蛋白及mRNA表达水平(P值均＜0.05).结论 mTOR途径在CML的发病中发挥重要作用,其靶向抑制剂雷帕霉素可通过阻断mTOR途径抑制K562细胞增殖.     

原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响

背景：与骨髓基质细胞黏附可介导白血病细胞耐药,而对于黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言,骨髓基质细胞在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。目的：构建慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型,探讨慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响。方法：自慢性髓细胞白血病患者骨髓分离、培养骨髓基质细胞,与K562细胞共培养构建骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型。MTT法检测伊马替尼IC50,Annexin V-FITC/PI标记暴露于0.5μmol/L伊马替尼72 h的K562细胞,流式细胞仪检测K562细胞凋亡率。收集与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞周期蛋白（Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E）的表达。结果与结论：基质细胞共培养组及悬浮培养组 K562细胞伊马替尼 IC50分别为（0.52±0.02）μmol/L 和（1.27±0.05）μmol/L,两者比较差异有显著性意义（P＜0.01）。0.5μmol/L伊马替尼处理72 h,共培养组及悬浮培养组凋亡率分别为（15.48±4.17）%和（32.01±6.83）%,两者比较差异有显著性意义（P＜0.01）。与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞G0-G1期细胞的比例为（48.81±8.27）%,明显高于悬浮培养组（25.78±3.26）%（P＜0.01）。慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养能介导 K562细胞对伊马替尼耐药,其机制可能与基质细胞共培养使K562细胞发生G0/G1细胞周期阻滞有关。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。     

Induction of leukemic-cell-specific cytotoxic T lymphocytes by autologous monocyte-derived dendritic cells presenting leukemic cell antigens

Leukemic-dendritic cells (leukemic-DCs) have certain limitations, which include difficult generation in 30-40% of patients, and low levels of expression of several key molecules. Therefore, an alternative approach using monocyte-derived DCs pulsed with tumor antigens is required. We investigated the possibility of immunotherapy for AML using leukemic-cell-specific cytotoxic T lymphocytes that were stimulated in vitro by autologous DCs pulsed with tumor antigens. To generate DCs, CD14(+) cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells using magnetic-activated cell sorting, and cultured in the presence of GM-CSF and IL-4. On day 6, maturation of DCs was induced by addition of cytokine cocktail (TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and prostaglandin E(2)) for 2 days, and then the mature DCs were pulsed with whole leukemic cell lysates or apoptotic leukemic cells. There were no differences in the phenotypic expressions of mature DCs generated by pulsing with or without leukemic antigens. The mature DCs pulsed with tumor cell lysates or apoptotic leukemic cells showed a higher allostimulatory capacity for allogeneic CD3(+) T cells as compared with mature non-pulsed DCs. Autologous CD3(+) T cells stimulated by the mature pulsed DCs showed more potent cytotoxic activities against autologous leukemic cells than those stimulated by mature non-pulsed DCs. These results suggest that use of DCs pulsed with leukemic cell lysates or apoptotic leukemic cells is a feasible alternative immunotherapeutic approach to overcome the limitations of leukemic-DCs for the treatment of AML patients.     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。     

热休克体外诱导自身T细胞对慢性髓系白血病细胞的杀伤

目的 研究热休克对慢性髓系白血病（ＣＭＬ）患自身Ｔ细胞杀伤（ＡＴＫ）肿瘤细胞活性的影响。方法 用＾５１Ｃｒ释放法检测自身Ｔ细胞对热休克处理的ＣＭＬ靶细胞（△ＣＭＬ）和未灯克处理的ＣＭＬ靶细胞（δＣＭＬ）的ＡＴＫ活性,用流式细胞仪检测ＣＭＬ细胞热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的表达,淋巴细胞混合培养（ＭＬＴＣ）法刺激扩增Ｔ细胞,并检测其免疫表才ＡＴＫ活性。结果 ２１例ＣＭＬ患中有４例显示对δＣＭＬ有     

A case of chronic myelogenous leukemia with the T315I mutation who progressed to myeloid blast phase and was successfully treated with asciminib

Patients with chronic myelogenous leukemia (CML) harboring the T315I mutation who progress to blast phase CML while on ponatinib may be successfully treated with asciminib monotherapy following induction therapy with cytotoxic chemotherapy.     

慢性HBV感染者外周血树突状细胞和T细胞体外应答功能的检测和分析

目的　探讨慢性HBV感染者外周血树突状细胞 (DC)和T细胞对激活剂体外应答的功能。方法　用三色荧光染色法 ,通过流式细胞仪检测静息期和经激活剂激活后CD11c DC和CD3 /CD4 /CD69 T细胞的百分率。结果　与接种过乙型肝炎疫苗、血中抗HBs阳性健康者相比 ,感染者组CD11c 型DC及其表达CD80和CD40共刺激分子的阳性细胞百分率 ,以及经CD2 /CD2R强激活剂刺激后CD69 T细胞百分率等三项指标均呈明显低下的状态。结论　慢性HBV感染者血中DC和T细胞对激活剂的体外刺激 ,均表现不同程度的应答功能低下或缺陷 ,本研究涉及的三项细胞免疫检测方法有利于深入了解机体对病原体应答的能力 ,其结果有助于阐明发病机理 ,可为临床拟定慢性HBV感染者免疫辩证治疗措施提供科学的有针对性的依据