种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

申克孢子丝菌基因型鉴定在临床诊断中的应用

目的：探讨申克孢子丝菌临床分离株的基因型鉴定在临床诊断中的应用。方法：使用PCR法扩增引起三种临床类型的申克孢子丝菌菌株核糖体保守区及内转录间隔区（5．8SrDNA，ITSII）的基因序列，并进行测序。结果：三株临床分离菌株核糖体保守区及ITSII区基因序列完全一致，经测定为申克孢子丝菌，该基因序列与基因库中申克孢子丝菌菌株（AB089138）相关序列的同源性达100％。结论：申克孢子丝菌的ITS区相对保守，通过对ITS段基因序列的测定可在基因水平上对孢子丝菌进行菌种鉴定，为临床快速、准确诊断和治疗提供确切依据。     

聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究

目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础。方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增。结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性。结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断。     

应用PCR技术快速鉴定申克孢子丝菌的实验研究

采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用申克孢子丝菌种特异性引物分别对21株申克孢子丝菌的基因组DNA进行PCR扩增.成功提取21株申克孢子丝菌基因组DNA,并用申克孢子丝菌种特异性引物分别从21株申克孢子丝菌基因组DNA中获得长度为320 bp的扩增产物.以申克孢子丝菌特异引物为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌简便、快捷、特异,可用于临床诊断.     

申克孢子丝菌基因型与临床表现型关系研究

目的了解申克孢子丝菌的基因学特征，探索其基因型特征与临床表现型的关系。方法收集不同临床型别孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株并提取DNA，再用随机扩增DNA多态性方法（RAPD）进行PCR扩增。结果①共选用10个随机引物进行扩增，筛选出4个具有较好扩增片段的引物。②不同菌株同-引物扩增均见-共有DNA片段。③不同临床型孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株带型有差异。结论随机扩增DNA多态性研究发现申克孢子丝菌具有一定的种内差异，其DNA带型与菌株的临床型有关。     

利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型

目的 利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系.方法 CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶ApaI酶切后的基因组DNA进行印迹杂交.结果 杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%.结论 探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性.     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

临床常见毛孢子菌的鉴定

为了探讨临床常见毛孢子菌（Trichosporon spp.)的鉴定方法，在形态学、营养生理学试验的基础上对临床常见的毛孢子菌－皮瘤毛孢子菌（Trichosporon inkin)、皮毛孢子菌（Trichosporon cutaneum)及阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii)进行核糖体核糖核酸（rRNA)基因（rDNA)的内转录间区（ITS）扩增，用限制性内切酶Cfr3I、NcoI对聚合酶链反应（PCR）产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析及序列测定，发现用Cfr13I做酶切，皮毛孢子菌的RFLP带型和阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不同；用NcoI做酶切，皮瘤毛孢子菌的带型与另两者不一致，序列分析的结果与形态学、营养生理学试验一致。结果提示，温度试验、API 20C、RFLP及序列测定可用于鉴定临床常见的毛孢子菌。     

临床分离99株孢子丝菌病原体的分子和表型鉴定

目的对99株来自我国十个省市孢子丝菌病患者组织分离的病原体进行分子鉴定和表型分析。方法对99株孢子丝菌核糖体基因ribosomal internal transcribed spacer(ITS)、钙调蛋白基因(Calmodulin,CAL)PCR多位点扩增、测序以及种系进化分析,并对其进行包括温度试验(30℃,35℃,37℃)、糖同化试验、不同培养基生长试验、双相转换试验等表型研究。结果依据ITS\CAL基因序列分析显示96株孢子丝菌被鉴定为球形孢子丝菌;37℃时有90.91%(90/99)生长受抑,9株不生长;99株同化蔗糖、96株不同化棉籽糖,3株同化棉籽糖;申克孢子丝菌的孢子形态多样。结论中国十省市的孢子丝菌以球形孢子丝菌为主,也存在申克孢子丝菌。     

rDNA-RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种间鉴定初探

目的 探讨rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术构建毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析,尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定。方法 收集8种14株毛孢子菌,对其进行rDNA-ITS/IGS1扩增测序,并分别应用HaeⅢ、HhaⅠ、HaeⅢ和HhaⅠ双酶、HinfⅠ、MspⅠ和TaqⅠ对扩增片段进行RFLP酶切。结果 rDNA-ITS-RFLP多酶切可将8种毛孢子菌分为不同进化分支的4个亚类,而rDNA-IGS1-RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定,并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分。结论 rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术有望用于毛孢子菌属种水平的快速鉴定。     

四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价

目的 筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物。方法 以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物。所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物,而对照菌株未出现者记为特异性引物,随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增,记录各引物出现阳性扩增结果时的最小模板浓度,检测敏感性。结果 在相同PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性,而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物。引物S2-R2的敏感性最好,基因组DNA模板浓度为5 pg/μL时即可被检出。结论 针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物。     

Rapid and specific identification of Sporothrix schenckii by PCR targeting the DNA topoisomerase II gene

BACKGROUND: In order to study the genotype variation of Sporothrix schenckii, we previously analyzed the genomic sequences of the DNA topoisomerase II genes of this fungus and S. schenckii-related species, such as S. schenckii var. luriei and Ceratocystis stenoceras. OBJECTIVE: To develop a PCR-based identification system that can distinguish S. schenckii from its related species for clinical diagnosis of sporotrichosis. METHODS: Based on the nucleotide sequences of the DNA topoisomerase II genes of S. schenckii, S. schenckii var. luriei and C. stenoceras, three gene-specific primers (SSHF31 and SSHR97 for S. schenckii, and SSLF64 for S. schenckii var. luriei) were designed and evaluated for their specificities in PCR amplifications. RESULTS: The primer set SSHF31/SSHR97 amplified PCR products of 663-817 bp from S. schenckii and approximately 660 bp from S. schenckii var. luriei, while SSLF64/SSHR97 exclusively amplified a major product of 305 bp from S. schenckii var. luriei. CONCLUSION: PCR targeting the DNA topoisomerase II gene specifically and rapidly distinguished S. schenckii from its related species.     

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的：应用内转录间隔区（ITS）通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种（8株）念珠菌菌县液进行PCR扩增。结果：两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌县液扩增出种特异的DNA多带，而第2对引物其种特异性更强。结论：采用ITS通用引物结合快速PCR检测法，可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。     

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。     

PCR反向线点杂交鉴定常见念珠菌的研究

目的 建立PCR反向线点杂交技术（PCR-RLB）快速检测和鉴定常见念珠菌的方法。方法 以念珠菌属间隔序列Ⅱ（ITS2）为靶基因设计通用引物，用生物素标记反义引物，PCR扩增白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌DNA，然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交，并进行临床标本和分离株的检测。结果 念珠菌标准菌株可扩增出302 ~ 441 bp DNA片段，6种特异性寡核苷酸探针可分别与相应念珠菌PCR产物杂交，其敏感性为10 cfu/mL。通过对100例分离株的检测，然后与培养法鉴定（Merieux Vitek）的结果比较，有97株与培养结果一致，另外3株通过DNA测序结果证实与PCR-RLB测定结果一致。通过对200例女性阴道拭子进行检测，PCR-RLB阳性率为49%，而涂片法和培养法阳性率分别为27%和39%，明显高于涂片法和培养法（P < 0.05）。结论 该方法可快速、敏感、准确鉴定临床上常见的念珠菌。     

红色毛癣菌基因型稳定性的研究

目的探讨红色毛癣菌基因型的稳定性。方法采用随机引物PCR法和探针与DNA印迹杂交法。以CTAB法提取DNA。随机引物为OPAA11[5-′ACCCGACCTG-3′],印迹法以NS5和ITS4(真菌的特异性引物)为引物,以红色毛癣菌的标准株为模板,扩增出rDNA的部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针,并用随机引物法将探针用P32标记,与EcoRⅠ酶切的基因组DNA杂交。结果①AP-PCR法:红色毛癣菌扩增的主要带型是2.2,1.7,1.3,0.9,0.7 kb,所试红色毛癣菌传代前后扩增带型均无变化。②探针与DNA印迹杂交法:原代(1代)与传代后的(2,3,4代)杂交带型一致,11株红色毛癣菌均表现为3条带,分两型(分子量分别为2.4,3.9,5.9 kb和2.4,4.4,6.5 kb)。结论红色毛癣菌基因型稳定。     

用任意引物聚合酶链反应进行皮肤癣菌的子生物学研究

目的探讨任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)方法对皮肤癣菌的分子生物学鉴定和分型的意义。方法用随机引物OPAA115'-ACCCGACCTG-3',OPD185'-GAGAGCCAAC-3'对皮肤癣菌的3个属9个种和孢子丝菌及白念珠菌共64个菌株进行AP-PCR,并对扩增产物进行电泳分析。结果皮肤癣菌所试验的9个菌种之间均产生具有明显差异的电泳带型。来自不同地区的红色毛癣菌经多次实验均出现主带相同的电泳带型,同时存在株间差异。结论以OPAA11和OPD18为引物,用AP-PCR可对皮肤癣菌从基因分子水平上进行鉴别,并为分型提供依据。