16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的研究以16S-23S rDNA内转录间隔区(intemal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种.方法应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株.结果分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp～450bp范围DNA片段.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的.5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平.结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值.     

16S—23S rDNA间隔序列PCR与RELP对分支杆菌临床分离株的鉴定价值

为阐明分支杆菌同种临床分离株不同菌株之间以及与标准株之间１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔序列是否有差异，以及结核分支杆菌耐药性和１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔序列有无关系。本文对５８株结核分支杆菌临床分离株（２０株敏感株，３８株耐药株）和淡黄、副偶然、母牛等分支杆菌的临床分离株的１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔序列进行了扩增，并对扩增产物进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳及限制性内切酶ＨａｅⅢ、Ｍｓｐ     

16S-23S rDNA间隔序列PCR与RFLP对分支杆菌临床分离株的鉴定价值

为阐明分支杆菌同种临床分离株不同菌株之间以及与标准株之间１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列是否有差异，以及结核分支杆菌耐药性和１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列有无关系。本文对５８株结核分支杆菌临床分离株（２０株敏感株，３８株耐药株）和淡黄、副偶然、母牛等分支杆菌的临床分离株的１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列进行了扩增，并对扩增产物进行了聚丙烯酰胺凝胶电和琼脂糖凝胶电泳及限制性内切酶ＨａｅⅢ、ＭａｐⅠ消化反应。同种分支杆菌各菌株之间扩增产物及限制性内切酶消化产物均无差异。不同种各株之间均不相同。结果说明同种分支杆菌不同临床分离株１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列没有差异，结核分支杆菌１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列与菌株耐药性没有关系。１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列ＰＣＲ扩增与ＲＦＬＰ分析对分支杆菌临床分离株的鉴定有价值。     

16s～23s rDNA间隔区序列聚合酶链反应鉴定术后龟分支杆菌暴发感染

目的　从基因水平上确认深圳市某医院术后暴发感染的致病菌,并建立一套快速的ＰＣＲ方法鉴定龟分支杆菌脓肿亚种。方法　根据分支杆菌的１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成一对引物和龟分支杆菌脓肿亚种ＤＮＡ探针,采用ＰＣＲ 和ＤＮＡ 斑点杂交技术,对５３ 株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ杂交。在此基础上,采用１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增体系检测２５９份临床标本,对部分标本做ＤＮＡ探针斑点杂交反应。结果　５３ 株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株均被扩增出一条特异的３８０ ｂｐ ＤＮＡ 带和出现特异的杂交斑点。２５９ 份临床标本,ＰＣＲ 扩增阳性率为６０－６％ 。结论　在基因水平上确认此次引起院内术后暴发感染的致病菌为龟分支杆菌脓肿亚种。１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增检测体系灵敏、特异,能鉴定龟分支杆菌。     

应用核糖体及其内转录间隔区基因同源性分析鉴定致病性真菌

近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用,以及肿瘤、器官移植等免疫低下人群的不断增多,念珠菌、隐球菌等深部真菌感染的发生率呈现明显上升趋势。一些新的致病性真菌或真菌的新特性也在不断地被认识,而对致病性真菌的鉴定则是其认识的基础与关键[1] 。我们应用真菌核糖体保守区及其内转录第2间隔区基因(ITS2 )序列同源性分析,为致病性真菌的分子鉴定提供一个客观依据。材料与方法一、菌株来源及其鉴定临床菌株(念珠菌、新生隐球菌、曲霉、耐热红色毛癣菌)均来源于我院真菌室保藏菌株;标准菌株(念珠菌、新生隐球菌、曲霉)均系美国菌…     

16S—23S rDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆？…

目的 从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立ＰＣＲ结合ＤＮＡ探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案。方法 根据偶然分支杆菌１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用ＰＣＲ扩增、ＲＦＬＰ和ＤＮＡ斑点杂交技术,对２９例偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定。结果 ２９例偶然分支杆菌临床分离株均被ＰＣＲ扩增出一条约４７０ｂｐ的ＤＮＡ条带,ＤＮＡ探针杂交也出现特     

赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的　构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)片段克隆,并进行测序及同源性分析。　方法　提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上,双脱氧链末端终止法测序。　结果　扩增出约 1000bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L.d.SC10和L.d.6分别为1027bp和1028bp。序列分析结果表明,L.d.SC10和L.d .6有一定差异。　结论　获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.SC10和L.d.6的前鞭体rDNAITS序列。     

分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析

目的　建立鉴定分支杆菌分离株的 16S - 2 3SrDNA转录间隔区 (internaltranscribedspacer ,ITS)序列分析的方法 ,用该方法对临床分离株进行鉴定。方法　对从重庆某医院分离的 2 9株分支杆菌菌株分别进行了PCR扩增 ,得到它们的16S - 2 3SrDNAITS片段 ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行鉴定。结果　在ITS序列分析中 ,有 10株的序列分别与结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriumtuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌 ,脓肿分支杆菌的序列完全一致。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;4株 16SrDNA序列分析不能准确鉴定的分离株中其中 3株(M 4、M 5、M 12 )鉴定为戈登分支杆菌 ,1株 (M 2 3)鉴定为脓肿分支杆菌。部分分离株的的ITS序列在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列 ,这些不同的序列之间的相似程度为 2 7.1%～ 99.2 %。用临床分离株的ITS序列与其最相似的已知分支杆菌的ITS序列构建的系统发育树 ,菌株分群与 16SrDNA序列构建的系统发育树的分群基本一致。结论　分支杆菌的16S - 2 3SrDNAITS序列比 16SrDNA序列有更大的多样性 ,该序列分析可作为     

16s—23srDNA间隔区序列聚合酶链反应鉴定术后龟分支杆 …

目的 从基因水平上确认深圳市某医院术后暴发感染的致病 ,并建立一套快速的ＰＣＲ方法鉴定龟分支杆菌脓肿亚种。方法根据分支杆菌的１６￣２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成卫对引物和龟分支杆菌脓肿亚种ＤＮＡ探针,采用ＰＣＲ和ＤＮＡ斑点杂交技术,对５３株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ杂交。在此基础上,采用１６￣２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增体系检测２５９份标本,对部分标本做ＤＮＡ探针斑点杂交反     

16S-23SrDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的研究

目的　从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立PCR结合DNA探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案。方法 根据偶然分支杆菌16S-23S rDNA间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用PCR扩增、RFLP和DNA斑点杂交技术,对29株偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定。结果 29株偶然分支杆菌临床分离株均被PCR扩增出一条约470bp的DNA条带,DNA探针杂交也出现特异的杂交斑点。结论 16S23SrDNA间隔区序列PCR扩增及DNA探针杂交在基因水平上确认引起此次注射后暴发感染的致病菌为偶然分支杆菌,该方法具有灵敏、特异的特点。     

采用16S rRNA序列分析法鉴定非结核分支杆菌

对第四次全国结核病流行病学抽样调查获得的经生化鉴定为非结核分支杆菌的 49株菌株进行了 16ＳｒＲＮＡ序列分析法鉴定 ,并与生化法进行了比较。材料与方法　菌株 :牛分支杆菌 (ＡＴＣＣ 192 10 ) ,偶然分支杆菌 (ＡＴＣＣ6841) ,标准菌株胞内分支杆菌 (ＡＴＣＣ 3 5 772 ) ,不产色分支杆菌 (ＤＳＭ 44 164 ) ,瘰疬分支杆菌 (ＤＳＭ 43 992 )均由国家结核病参比实验室提供。获取方法 :参照《第四次全国结核病流行病学抽样调查工作手册 (修订本 )》。聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增 16ＳｒＲＮＡ的片段 :取罗氏培养基培养的非结核分支杆菌 ,灭活…     

采用16SrRNA序列分析方法鉴定第四次全国结核病流调的非结核分支杆菌

目的 从核苷酸序列水平建立一种非结核分支杆菌的鉴定方法，以用于其流行病学调查。方法 对第四次全国结核病流行病学抽样调查获得的49株非结核分支杆菌，采用16SrRNA基因片段序列分析的方法进行鉴定，结果 五株标准菌株的测序结果与其命名完全相符。49株流调非结核分支杆菌中．41株可明确鉴定，4株不能明确鉴定到种，4株扩增失败无法鉴定。所占比例较高的菌种为：不产色分支杆菌(7/41)，土地分支杆菌(6／41)，胞内分支杆菌(5／41)，偶然分支杆菌(4／41)。结论 在基因水平上较客观地了解我国目前可引起可疑肺结核症状的非结核分支杆菌的流行状况。16SrRNA基因片段序例分析鉴定非结核分支杆菌的方法快速、简便、准确并可发现一些新的菌种。     

常见分枝杆菌不同株16S-23S rRNA转录间隔区序列分析

目的 分析常见分枝杆菌不同株之间的因型,为临床分离株的鉴定提供参考序列.方法 用16S-23S rRNA转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析法对94株由德国微生物和细胞保藏中心(DSMZ)引进的常见分枝杆菌进行种内不同株的基因型分析,并分别与12株国际标准株对比.通过种内不同株间同源性序列比对,绘制16S-23S rRNA ITS序列聚类分析树状谱,使用DNAStar的MegAlign软件计算株间相似性百分比.结果 成功完成上述共106株菌株的16S-23SrRNA ITS测序,发现除胞内分枝杆菌(4株)、鸟分枝杆菌(4株)、海分枝杆菌(6株)和马尔摩分枝杆菌(2株)各有一个基因型且与标准株相同外,其他分枝杆菌均可分为数个不同基因型.结论 16S-23S rRNA ITS序列分析可以根据种内各株的不同基因型将分枝杆菌鉴定到株,是分枝杆菌基因型分析的可靠方法.     

应用多重聚合酶链反应技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的 建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(BCG)菌株的方法。方法 依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1，RD1)的基因区，而其他牛分支杆菌菌株和其他结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息，应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否，以鉴别BCG菌株与其他牛分支杆菌菌株及其他MTC菌种。结果 所试5株BCG疫苗生产用标准菌株和近期国内发生的1例小儿BCG接种后全身播散性感染致死病例的2株BCG分离菌株，均缺失RD1基因区；其他牛分支杆菌菌株，包括3株牛分支杆菌标准菌株、5株分别从结核病牛或鹿分离的牛分支杆菌菌株，1株从结核病患痰标本分离的牛分支杆菌菌株，以及其他MTC菌种，包括结核分支杆菌H37Rv和H37Ra标准菌株、48株从结核病患痰标本分离的结核分支杆菌菌株、3株非洲分支杆菌标准菌株，均存在RD1区。结论子多重PCR技术用于牛分支杆菌BCG菌株的鉴定简便、快速、特异，适于在临床实验室应用。     

噬菌体在结核分支杆菌研究中的应用

从 1 947年第一个分支杆菌噬菌体被分离到现在 ,陆续发现的分支杆菌噬菌体超过 2 50种。分支杆菌噬菌体是一种ＤＮＡ病毒 ,因对分支杆菌有特异性而得名。 1 947年 ,Ｇａｒｄｎｅｒ首次分离并命名了分支杆菌噬菌体。之后 ,不同种分支杆菌噬菌体陆续被分离 ,迄今为止 ,从不同来源的标本中分离的分支杆菌噬菌体已超过 2 50种。随着人类对噬菌体结构和功能的不断了解 ,噬菌体作为一种研究工具的功能正逐步被开发 ,一些相关机制正逐步被阐明。分支杆菌噬菌体Ｌ5、Ｄ2 9的全基因序列已被阐明 ,必将对噬菌体研究领域产生重要影响[1 ] 。分支杆菌噬…     

分子诊断技术在分支杆菌菌种鉴定中的应用价值

在微生物分类中 ,分支杆菌属于裂殖菌纲、放线菌目、分支杆菌科、分支杆菌属。分支杆菌种类繁多 ,《伯杰系统细菌学手册》(第九版 )所确认的分支杆菌有 5 4种 ,临床可见能引起人类疾病的主要是结核分支杆菌 (ＭＴＢ) ,此外还有堪萨斯、鸟、胞内、猿猴、蟾蜍、海、溃疡、瘰疬、马尔摩、苏加、偶然、龟、脓肿等 10余种非结核分支杆菌 (ＮＴＭ)。ＮＴＭ病具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损害 ,在无菌种鉴定结果的情况下 ,与结核病难以鉴别。ＮＴＭ与ＭＴＢ药物敏感性大不相同 ,许多ＮＴＭ对抗结核药物天然耐药 ,不同ＮＴＭ菌种对…     

16S rDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的价值研究

目的评价16S rDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的应用价值。方法对 13种49株诺卡菌(43株标准株和6株临床株)16S rDNA序列片段进行PCR扩增,将扩增片段进行纯化后测序,从GenBank上下载32株诺卡菌(包括星形诺卡菌,少食诺卡菌,短链诺卡菌等)及3株棒状杆菌(Corynebacterium,C.),3株弗兰克氏菌属(Frankia,F.),3株分支杆菌(Mycobacterium,M.),3株链霉菌(Streptomyces,S.)的16S rDNA序列。对所测得的诺卡菌序列及GenBank所报道的诺卡菌序列用DNASTAR程序分析处理,计算种内及种间相似性,用Mega6.06构建诺卡菌菌种系统进化树。结果在81条受试诺卡菌16S rDNA序列中,16S rDNA能将诺卡菌大致可分为11群,除了不能将亚种分离外,诺卡菌其他种属均能得到很好的分离。诺卡菌16S rDNA种内及亚种内相似性为99.1% ~ 100%;种间相似性在95.7% ~ 98.8%之间。结论16S rDNA序列分析是一种快速,简单,特异性较好的诺卡菌菌种鉴定方法,能将诺卡菌鉴定至种的水平。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

应用扩增直接重复序列DNA片段对泰国结核分支杆菌菌株基因差异的研究

背景:发展并使用一种用于研究结核分支杆菌基因差异的聚合酶链反应(PCR)设计:结核分支杆菌H_(37)Rv的两个多态性DNA片段被鉴定和测序。然后引物被设计以用于对两个多态性片段同时进行扩增。该方法被用于研究179例临床结核菌分离株,这些菌株以前曾用IS6110的Southern杂交鉴定。结果:两个多态性片段均含有直接重复序列。其中一个片段的直接重复序列位于α-异丙基苹果酸酯合成酶基因的编码序列之间。179个菌株的两个片段经过扩增后,PCR产物的40个型能够被鉴定。该方法能够将38个IS6110单带菌株区分为23个型。属于北京家族的菌株中的大多数具有与H_(37)Rv相同的PCR产物。Nonthaburi组成员的PCR产物彼此间是相似的。结论:这些结果符合北京家族和Nonthaburi组成员起源于两个共同祖先的假说。该PCR方法可能有助于对含IS6110单拷贝的结核菌菌株进行区分。