原代小胶质细胞及神经元细胞培养不同纯化方法的比较

目的探讨建立简便高效的原代小胶质细胞及神经元培养和纯化方法。方法神经元与胶质细胞混合培养后,采用温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法及手摇法分离纯化小胶质细胞,无血清培养法及阿糖胞苷法分离纯化神经元,细胞计数、流式细胞术及细胞化学染色鉴定小胶质细胞及神经元。结果手摇法分离纯化小胶质细胞与温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法比较,细胞产量更高、活性更好;无血清培养法培养神经元比阿糖胞苷法细胞纯度更高、活性更好,形成神经网络结构的时间也更早。结论手摇法分离纯化小胶质细胞是产量最高、简便、经济的方法,而无血清培养法更能提高神经元的纯度及活性。     

受体相互作用蛋白140在小鼠原代小胶质细胞中的表达分析

目的:分离、纯化和原代培养小鼠的小胶质细胞并检测该细胞中受体相互作用蛋白140(RIPl40)的表达模式.方法:以McCarthy等的经典培养方法为基础进行小鼠小胶质细胞的分离,以不换液营养缺失法、机械振摇法纯化和培养小鼠小胶质细胞;用CD11b(MAC-1)对分离的小鼠小胶质细胞进行鉴定;采用实时-聚合酶链反应和western免疫印迹法检测RIP140 mRNA和蛋白质在小鼠原代小胶质细胞中的表达模式:用免疫细胞化学确定RIP140在小胶质细胞中的定位表达模式.结果:成功对小鼠小胶质细胞进行了分离、纯化和培养;mRNA和蛋白表达分析显示,RIP140在小鼠原代小胶质细胞中确有表达,免疫组化结果提示RIP140主要在小鼠小胶质细胞的细胞核中表达.结论:利用McCarthy经典改良方法可成功分离纯化出高纯度小鼠原代小胶质细胞;小鼠原代小胶质细胞确实表达RIP140,以细胞核表达为主.     

小胶质细胞培养、分离、纯化和鉴定的初步研究

目的：探讨培养、纯化小胶质细胞的方法。方法：新生大鼠，取脑组织捣碎、消化、培养。用振摇法分离小胶质细胞，并进行传代、鉴定。结果：分离、培养的小胶质细胞，细胞折光性强，圆形，一些细胞有短的突起，小胶质细胞特异性标记抗体CD68免疫化学染色显示小胶质细胞的纯度在95％以上。结论：本实验方法所培养的小胶质细胞纯度高，为其功能研究奠定了基础。     

小鼠小胶质细胞原代培养的高产改良方法

目的探索与改良建立简单高效的小鼠原代小胶质细胞的培养与分离纯化方法。方法选用新生1～2 d的近交系C57BL/6小鼠,结合与改进营养剥离法并在恒温震摇法纯化后差速贴壁以分离纯化小胶质细胞。用Iba1免疫细胞化学染色方法对分离纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定。结果共收获2批小胶质细胞,经免疫细胞化学染色法鉴定,纯化分离的是小胶质细胞,并稳定获得超过1.59×105/25 cm2个,纯度达97%。结论改良过后的胶质细胞的培养纯化方法,操作简单,所需时间短且产量高,提高了原有的分离纯化效率。获得的细胞稳定,活性强纯度高。为体外研究培养小胶质细胞提供了更稳定的基础。     

人胎脑星形胶质细胞原代分离培养及鉴定

目的探索并建立人胎脑星形胶质细胞的原代培养方法.方法分别以组织块法和消化法分离、培养和纯化人胎脑星形胶质细胞,并用形态学观察和免疫细胞化学方法进行鉴定.结果组织块法的培养效果优于消化细胞培养法;原代培养、纯化的细胞生长稳定,经鉴定为星形胶质细胞.结论采用组织块法原代培养人胎脑星形胶质细胞,简单易行、所获细胞纯度高,可用于体外星形胶质细胞的进一步研究.     

新生鼠脑皮层星形胶质细胞培养及鉴定

目的：旨在获得较纯的星型胶质细胞，为进一步研究奠定基础。方法：采用细胞分离培养一差速粘附法。胰酶消化及机械吹打，分离SD新生1周大鼠大脑皮层细胞，用含20％血清DMEM／F12培养基培养。并以GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果：经原代及传代培养，获得大量几乎为单一种类细胞，其特点为胞体较大，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体一侧，细胞突起较多较长，符合星形胶质细胞形态。GFAP-FITC免疫荧光染色绝大多数细胞为强阳性。结论：细胞分离培养-差速粘附法可获得较纯的星形胶质细胞。     

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

目的：建立原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系.方法：取新生24 ～48 h的SD大鼠,无菌操作取出大脑皮层,剪碎后用胰酶消化、机械吹打制成分散细胞悬液,网筛过滤,将细胞悬液接种培养7～9d;置于摇床（37℃、250 r/min振摇6h）,弃掉含脱离细胞的细胞悬液,去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞传代,进行GFAP细胞免疫荧光鉴定.结果：成功分离和培养原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞比例在95％以上.结论：采用该培养方法能够成功的建立原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系,为研究神经系统疾病及其相关疾病提供了可靠的细胞模型.     

体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化

目的：通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞（AS）分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法：结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果：体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论：优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.     

大鼠神经干细胞体外培养的研究

目的：比较两种不同的分离培养方法对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。方法：分离新生24小时内的SD大鼠脑组织细胞,采用无血清培养技术进行体外扩增培养,分别以机械吹打法和胰酶消化法两种方法进行扩增培养、传代。免疫细胞化学法对NSCs 及其分化后的细胞进行Nestin,NSE,GFAP,CNP的鉴定。结果:分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力及Nestin 表达阳性,诱导后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。无论第一代或第二代比较,胰酶消化组NSCs 的增殖明显高于机械吹打组。结论:实验中分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs ,可诱导分化为终末神经细胞。在两种分离培养方法中,以胰酶消化法培养可获得更多的NSCs 。     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.     

改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单,可行的兔成纤维样滑膜细胞体外培养方法。方法无菌条件下取正常兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,用CCK-8法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果体外培养的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"型,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论改良组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求。     

骨膜成骨细胞分离培养的方法

目的：探讨骨膜成骨细胞分离培养的最佳方法,为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子为源,方法：分别以组织块法,酶消化法和联合法分离培养兔骨成骨细胞,观察原代培养的成功率,细胞生长曲线,成骨细胞的表型特征,结果：组织块法原代培养耗时较长,成功率低,酶消化法细胞增殖快但有大量的杂细胞掺入,联合法提高了组织块成活率,并维持了较高的成骨细胞表型,结论：胶原 时预消化的联合法能够在较短时间内获得高纯度的成骨细胞,效果优于传统的组织块法和酶消化法,有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

一种改良的肺微血管内皮细胞培养方法

目的对目前常用的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法进行改良,以期建立较为容易获取纯化的小鼠PMVECs的方法。方法应用C57小鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养PMVECs,光镜观察细胞形态,Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原免疫细胞化学法鉴定培养的PMVECs,并比较改良培养方法与传统培养方法的优越性。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈类圆形或短梭形,形成单层后呈铺路石样排列,Ⅷ因子相关抗原和CD31荧光染色阳性,利用改良的培养方法培养的细胞生长较传统方法更加快速,分布更加均匀。结论改良的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,克服细胞生长缓慢、杂细胞容易污染等难题,是一种较为理想的培养方法。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

目的探讨成年大鼠原代骨骼肌卫星细胞体外培养方法,观察细胞的增殖、成肌分化特性。方法采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化鉴定所获取细胞的肌源性标志desmin。MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图。同时观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性。结果所分离的原代骨骼肌卫星细胞纯度在90%以上。细胞体外培养时在第3天进入对数生长期,5～6d进入增殖平台期。细胞体外培养时无须特殊诱导可以自发出现成肌定向分化,相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

目的在传统肝细胞提取方法的基础上,优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法,为从事肝脏功能相关研究人员提供改良的实验方法参考。方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后,剪碎,肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞,转入培养基培养。采用台盼蓝染色计算细胞活力,流式细胞检测技术计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度和活力的肝细胞,具备肝细胞的典型形态特征。结论通过逆向灌注,降低了灌注的难度,同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞,经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。