利用PCR技术优化人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因

本研究利用ＰＣＲ技术将人单核细胞趋化蛋白－１基因（ＭＣＰ－１）５′端翻译起始区进行优化改构。结果表明，改构后的ＭＣＰ－１基因克隆入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中，ＤＮＡ测序证实正确。上述结果为进一步研究ＭＣＰ－１的高效表达奠定了基础。     

人单核细胞趋化蛋白—1融合表达质粒的构建

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ构建人单核细胞趋化蛋白－１融合表达质粒ＰＧＴ－ＭＣＰ－１,方法：采用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ重组技术,结果：将编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）基因克隆至融合表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ ,ＤＮＡ测序证实正确。结论：获得融合表达的质粒ＰＧＴ－ＭＣＰ－１,为进一步研究ＭＣＰ－１的同效表达奠定了基础。     

单核细胞趋化蛋白1与细胞凋亡

单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)是一种分泌型单链蛋白质,为趋化因子家族成员之一,可通过G蛋白耦联受体途径诱导趋化性的产生,是调节单核巨噬细胞迁移及浸润的主要趋化因子之一。MCP-1参与多种疾病的细胞凋亡过程,并在凋亡机制中发挥重大作用。现就其特点、功能及与细胞凋亡性疾病的关系予以综述。     

人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞核细胞趋化蛋白１（ｈｕＭＣＰ－１）。方法：从人外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ。将ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ插入融合表达载体ｐＧＥＸＩＮ,１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后获得高效表达。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证明与ｈｕＭＣＰ－１单克隆抗体有明显交叉反应。结论     

蛋白酶活化受体1介导人胚肺成纤维细胞释放单核细胞趋化蛋白-1

目的：研究蛋白酶活化受体1（PAR1）对凝血酶诱导人胚肺成纤维细胞（HFL-1）释放单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的调节作用。方法：HFL-1用PAR1激动剂凝血酶、PAR1活性肽SFLLR和反活性肽RLLFS进行诱导,并用PAR1阻断剂SCH79797进行阻断后用凝血酶和SFLLR刺激;用ELISA检测MCP-1浓度。结果：凝血酶及SFLLR可引起HFL-1释放MCP-1,而RLLFS不能引起MCP-1的释放增加;SCH79797可阻断凝血酶及SFLLR诱导HFL-1释放MCP-1。结论：PAR1介导凝血酶诱导的HFL-1细胞释放MCP-1。     

凝血酶诱导人肺成纤维细胞释放单核细胞趋化蛋白-1

目的：研究凝血酶对人肺成纤维细胞（HFL-1）释放单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的调节作用。方法：HFL-1分别培养于96孔培养板各孔内,不同浓度（0．001-300nmol／L）凝血酶诱导2、6、9、12、24h后,收集上清液并用ELISA法检测其MCP-1浓度。结果：凝血酶可诱导HFL-1释放MCP-1,其最高释放量是基础分泌量的近17倍。凝血酶诱导的HFL-1释放MCP-1呈浓度和时间相关性。结论：凝血酶可诱导HFL-1表达MCP-1。     

单核细胞趋化蛋白-1与肺栓塞

近年来急性肺栓塞后肺部炎性反应倍受关注,越来越多的研究表明,多种炎性因子在急性肺栓塞中表达有升高。单核细胞趋化蛋白1作为炎性趋化因子CC亚族的一员,在趋化单核细胞和T淋巴细胞,诱导单核细胞、内皮细胞表达黏附分子,使各种炎性细胞尤其是单核/巨噬细胞向病变部位聚集的过程中发挥了决定性作用,而这种炎症过程可能参与了急性肺栓塞炎性反应的发病过程。     

单核细胞趋化蛋白1及其受体CCR2与冠心病关系的研究进展

冠状动脉粥样硬化性心脏病是一种慢性炎症性疾病,炎性反应在动脉粥样硬化(AS)发生、发展及其并发症的产生过程中起着重要作用,而趋化因子及受体在炎性反应中起关键作用。其中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)被认为是AS发生早期的关键因素,它与其特异性受体CC类趋化因子受体2(CCR2)结合后,趋化并激活单核/巨噬细胞,促进炎性反应的发生,从而产生生物学效应。现就MCP-1及CCR2在冠心病炎性反应过程中的作用,以及治疗冠心病的可行方案予以综述。     

突变型单核细胞趋化蛋白-1构建及其对单核细胞趋化蛋白-1的干预作用

目的:构建表达N端2-8位氨基酸缺失的突变型单核细胞趋化蛋白-1(mMCP-1),并观察其对单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的干预作用.方法:Megaprimer-PCR构建mMCP-1-pVAX1(pVMm).以脂质体将pVMm转染真核细胞系C2C12,ELISA分析mMCP-1的表达情况.采用趋化实验分析mMCP-1对病毒性心肌炎小鼠外周血单个核细胞(PMNCs)的趋化活性及其对MCP-1的干预作用.结果:①酶切和测序显示野生型MCP-1真核表达载体(pVM)和pVMm构建成功.pVMm在真核细胞C2C12中有效表达.②mMCP-1不具有趋化病毒性心肌炎小鼠PMNCs的活性.与单纯使用MCP-1相比,以不同浓度的mMCP-1和MCP-1同时行趋化实验,被趋化的细胞明显减少(P＜0.01),25 μg/L mMCP-1可阻断10 μg/L MCP-1对病毒性心肌炎小鼠PMNC的趋化活性.结论:小鼠MCP-1 N端2-8位氨基酸决定其趋化活性.mMCP-1可用于干预MCP-1的作用.     

单核细胞趋化蛋白1与肺部疾病

大部分肺部疾病的发生机制十分复杂,目前认为其病变的发生与发展是趋化因子、细胞因子和活性代谢产物等综合作用的结果。单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)是一种分泌型单链蛋白质,为趋化因子家族成员之一。目前的研究已经表明,MCP-1在肺损伤、肺血栓、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺部肿瘤、肺结核等肺部疾病中发挥重大作用。现就其特点、功能及与这些肺部疾病的关系予以综述。     

人CCR5 5′侧翼调控序列克隆测定及基序分析

目的：克隆人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列及其基序分析。方法：设计单引物,利用单向多循环ＰＣＲ扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ,ＰＣＲ产物作为序列分析模板。结果：得到长为１．５ｋｂ的人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ序列,并对该区域的基序进行了分析。结论：该方法适合于基因组ＤＮＡ,特别是逆向扩增一些读框区５′侧翼调控序列。     

内脏脂肪素促进内皮细胞合成单核细胞趋化蛋白1和白介素6的实验研究

目的 探讨内脏脂肪素是否能调节内皮细胞单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白介素6(IL-6)生成以及胰岛素受体(IR)的介导作用.方法 不同剂量和不同干预时间的内脏脂肪素刺激3～5代脐静脉内皮细胞(HUVEC);然后在内脏脂肪素(100 ng/m1)刺激基础上加入IR酪氨酸激酶抑制剂预处理HUVEC,24 h后测定MCP-1和IL-6蛋白和基因表达.酶联免疫吸附法和实时定量聚合酶链反应检测MCP-1和IL-6蛋白和mRNA表达.结果 内脏脂肪素剂量和时间依赖性促进HUVEC合成MCP-1[剂量效应:对照组:(62±10) pg/ml、100 ng/ml:(273±65) pg/ml、500 ng/ml:(1630±103) pg/ml;时间效应:对照组:(37±27) pg/ml、12 h:(184±56) pg/ml、48 h:(328±80) pg/ml]和IL-6[剂量效应:对照组:(31.8±1.7) pg/ml、100 ng/ml:(42.5±5.7) Pg/ml、500 ng/ml:(154.7±10.2) pg/ml;时间效应:对照组:(15.7±3.4) pg/ml、12 h:(35.4±4.7) pg/ml、48 h:(77.6±11.8) pg/ml].IR酩氨酸激酶抑制剂抑制内脏脂肪素诱导的MCP和IL-6蛋白和基因表达.结论 内脏脂肪索能诱导HUVEC合成和分泌MCP-1、IL-6,其作用通过IR信号通路介导.     

急性冠脉综合征患者血清可溶性E-选择素和单核细胞趋化因子-1水平变化

目的 观察血清可溶性E-选择素(soluble E-selectin,SES)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protin-1,MCP-1)水平在急性冠脉综合征(ACS)患者中的变化,并探讨其与斑块稳定性的关系. 方法 40例急性心肌梗死患者(AMI组)、40例不稳定型心绞痛患者(UAP组)、40例稳定性心绞痛患者(SAP组)及40例非冠心病患者为对照组,均用酶联免疫吸附法(ELISA)检测SES和MCP-1. 结果 AMI组和UAP组血清SES和MCP-1水平显著高于SAP组(均P<0.01),也显著高于对照组(均P<0.01),AMI组和UAP组之间血清SES和MCP-1水平差异无统计学意义(P>0.05). 结论 血清SES和MCP-1水平与ACS的发生、发展有关,并反映斑块的不稳定性.     

单核细胞趋化蛋白-1对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 研究单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, hUVEC)凋亡的影响.方法 培养并鉴定人脐静脉内皮细胞;用不同浓度MCP-1(0.1、1.0、10、100 μg/L)对其作用24、48 h;先用MTT比色法观察细胞存活率、流式细胞技术检测细胞DNA含量及细胞周期观察其对hUVEC凋亡的影响.结果 单核细胞趋化蛋白-1能诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P＜0.05),其效应随浓度和时间的增加而增强:MTT明显减低;细胞DNA含量减少,出现明显亚G0/G1峰(凋亡细胞峰).结论 单核细胞趋化蛋白-1能诱导人脐静脉内皮细胞凋亡.     

白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CCR5表达的影响

目的:观察白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CC型趋化因子受体5(CCR5) 表达的调节作用.方法:采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞.采用IFN-γ(1×105U/L)诱导单核/巨噬细胞表达CCR5,再分别加入不同浓度的白藜芦醇(0.5,5,25,50和100 μmol/L)进行干预.培养24 h后收集细胞,RT-PCR法检测外周血单核/巨噬细胞CCR5 mRNA表达水平;流式检测单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率.同时将CCR5荧光素酶报告基因(pGL3-Basic-CCR5)转染各组细胞,检测各转染组的荧光素酶相对活性.结果:中、高浓度白藜芦醇处理组(25,50和100 μmol/L)的CCR5 mRNA表达水平、CCR5阳性细胞率和CCR5-luc报告基因的荧光素酶相对活性比对照组均有所降低,低浓度白藜芦醇处理(0.5和5 μmol/L)对单核/巨噬细胞CCR5的表达无明显影响.结论:中、高浓度白藜芦醇可抑制外周血单核/巨噬细胞CCR5的表达.     

上尿路结石游离氨基酸分析

本文采用Ｐｉｃｏ－Ｔａｑ（美国Ｗａｔｅｒｓ公司商标名）氨基酸分析法，对２５例不同时期输尿管、肾结石（早期结石５例，中期结石７例，晚期结石１３例，２５例结石全为草酸盐结石）进行了游离氨基酸分析。初步结果表明，早、中、晚各期结石中均含有游离的氨基酸，且早期结石中游离氨基酸总含量明显高于中期和晚期（Ｐ＜０．００１），而中期和晚期之间无明显差异（Ｐ＞０．０５）。     

冠心病患者Fractalkine、单核细胞趋化蛋白-1和白细胞介素-8的检测及意义

目的:探讨趋化因子Fractalkine、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-8(IL-8)在不同类型冠心病(CHD)患者血清表达水平的变化及意义。方法:采集经冠状动脉造影确诊的稳定型心绞痛(SA)组患者48例、不稳定型心绞痛(UA)组患者56例、急性心肌梗死(AMI)组患者37例外周血标本,同期住院而冠状动脉造影正常的50例患者外周血标本作为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测4组血清Fractalkine、MCP-1和IL-8的表达水平,并以国际通用的Judkins法评估冠状动脉病变程度。结果:CHD患者血清Fractalkine、MCP-1和IL-8水平均明显高于对照组(P<0.01),UA和AMI组Fractalkine、MCP-1和IL-8水平均显著高于SA组(P<0.01);多支病变组和双支病变组Fractalkine、MCP-1和IL-8均明显高于单支病变组(P<0.01);重度狭窄组和中度狭窄组Fractalkine、MCP-1和IL-8水平亦显著高于轻度狭窄组(P<0.01)。结论:随着CHD患者病情的加重,血清趋化因子Fractalkine、MCP-1和IL-8水平明显升高,可用以评估CHD患者疾病的严重程度并监测疾病的进展情况。     

Role of Toll-like receptor 4 and human defensin 5 in primary endocervical epithelial cells

Background Endocervical epithelial cells play early roles in the defense of upper female genital tract to pathogens. Toll-like receptors (TLRs) and human defensins (HD) have recently been identified as fundamental components of the innate immune responses to bacterial pathogens. We aimed to use in vitro model of human primary endocervical epithelial cells (HPECs) to investigate their roles in innate immune response of the endocervix.Methods TLR4 expression and distribution in HPECs and endocervix were investigated by immunofluorescence (IF). Cultured HPECs were divided into lipopolysaccharide (LPS) group which were treated by LPS for 0, 24 and 48 hours, and control group without treatment. At each time point, the levels of HD5, IL-6 and TNF-a in supernants were determined by ELISA. TLR4 and HD5 expressions of cells were detected by Western blotting simultaneously. HD5 expression pattern was also compared between the HeLa cell line and HPECs.Results Endocervix tissue surface and HPECs expressed TLR4. After incubated with LPS, HPECs expressed significantly higher levels of TLR4 than control group, especially after 24 hours (P <0.01), however decreased after 48 hours with a similar level of TLR4 expression compared with control group. LPS could upregulate the secretion of HD5, IL-6 and TNF-α in a time-dependent manner (24 hours: P <0.05; 48 hours: P <0.01, compared with control group). Intracellular HD5 expression levels decreased over time. HD5 expression patterns in HPECs were different from HeLa cell line.Conclusions To respond to LPS stimulation, HPECs may function in the mucosal immune defense through TLR4 activation and HD5 secretion. HPEC is considered a significant model for immunological study.     

Role of Toll-like receptor 4 and human defensin 5 in primary endocervical epithelial cells

Background Endocervical epithelial cells play early roles in the defense of upper female genital tract to pathogens. Toll-like receptors (TLRs) and human defensins (HD) have recently been identified as fundamental components of the innate immune responses to bacterial pathogens. We aimed to use in vitro model of human primary endocervical epithelial cells (HPECs) to investigate their roles in innate immune response of the endocervix.Methods TLR4 expression and distribution in HPECs and endocervix were investigated by immunofluorescence (IF). Cultured HPECs were divided into lipopolysaccharide (LPS) group which were treated by LPS for 0, 24 and 48 hours, and control group without treatment. At each time point, the levels of HD5, IL-6 and TNF-a in supernants were determined by ELISA. TLR4 and HD5 expressions of cells were detected by Western blotting simultaneously. HD5 expression pattern was also compared between the HeLa cell line and HPECs.Results Endocervix tissue surface and HPECs expressed TLR4. After incubated with LPS, HPECs expressed significantly higher levels of TLR4 than control group, especially after 24 hours (P <0.01), however decreased after 48 hours with a similar level of TLR4 expression compared with control group. LPS could upregulate the secretion of HD5, IL-6 and TNF-α in a time-dependent manner (24 hours: P <0.05; 48 hours: P <0.01, compared with control group). Intracellular HD5 expression levels decreased over time. HD5 expression patterns in HPECs were different from HeLa cell line.Conclusions To respond to LPS stimulation, HPECs may function in the mucosal immune defense through TLR4 activation and HD5 secretion. HPEC is considered a significant model for immunological study.     

冠状动脉介入治疗对冠心病血浆超敏C反应蛋白和单核细胞趋化因子-1水平的影响

目的 通过测定冠心病病人行冠状动脉介人治疗前后血浆超敏C反应蛋白(hs-CRP)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)水甲的改变,探讨冠状动脉介入治疗埘冠心病病人炎症指标及术后再狭窄的影响.方法 连续入选经冠状动脉介入治疗单支病变的冠心病病人80例,40例经冠状动脉造影证实冠状动脉正常的人作为对照组.分别采用免疫浊度法和酶联免疫吸附法检测人选病人冠状动脉介入治疗前后hs-CRP和MCP-1水平.结果 (1)冠状动脉介入组病人术后血浆hs-CRP为(2.37±0.56)μg/L,显著高丁术前的(1.59±0.41)μg/L(P,0.01),而对照组冠状动脉造影术后hs-CRP为(1.18±0.37)μg/L与术前的(1.13±0.32)μg/L相比差异无统计学意义(P>0.05).(2)冠状动脉介入组病人术后血浆MCP-1为(26.04±5.43)pg/L,显著高于术前的(18.07±4.30)pg/L(P<0.01),而对照组冠脉造影术后MCP-1为(9.80±2.64)pg/L,与术前的(9.63±2.52)pg/L相比差异无统计学意义(P>0.05).结论 冠脉介入治疗促进冠心病病人血浆hs-CRP及MCP-1水平的升高,是否为冠脉介入治疗术后支架内再狭窄的重要机制之一尚待进一步考证.