抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅴ CD3AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析

MHC(Maior histocompatibility complex, MHC)Ⅰ类抗原缺失是一些肿瘤细胞逃逸抗原特异性CTL攻击的重要机制。CTL能否通过MHC非限制性、MHC Ⅰ类非依赖性机制杀伤肿瘤细胞是值得深入探讨的。我们用抗CD3单抗和rIL-2共刺激法诱导的CD3AK作为效应细胞,研究了CD3AK对两株MHCⅠ类阴性肿瘤细胞株K562和Daudi杀伤作用,初步分析了其机制:(1)CD3AK对K562和Daudi都有细胞毒作用,分别为49.4±5.8和33.5±2.5％;同血源NK细胞对K562细胞的细胞毒活性为8.2±3.2％,Daudi对NK的杀伤作用不敏感。(2)CD3AK可与K562细胞结合,EDTA抑制这一过程。(3)CD3AK通过诱导靶细胞K562坏死     

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅴ CD3AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析

MHC(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类抗原缺失是一些肿瘤细胞逃逸抗原特异性CTL攻击的重要机制。CTL能否通过MHC非限制性，MHC Ⅰ类非依赖性机制杀伤肿瘤细胞是值得深入探讨的。我们用抗CD3单抗和rIL-2共刺激法诱导的CD3AK作为效应细胞，研究了CD3AK对两株MHC Ⅰ类阴性肿瘤细胞株K562和Daudi杀伤作用，     

ICA,PJM逆转肿瘤细胞恶性表型及其机制的研究

目的:研究ICA,PJM逆转肿瘤细胞恶性表型,提高免疫效应细胞识别和杀伤的作用和机制。方法:MTT法检测ICA,PJM对PG细胞增殖的影响以及对CD3AK杀伤敏感性的影响;RT-PCR法检测ICA,PJM对bcl-2和c-fos基因mRNA表达水平的影响;流式细胞术检测细胞表面HLA-A,B,C抗原表达的变化以及c-fos,bcl-2蛋白表达水平的变化。结果:ICA,PJM对PG细胞有明显的增殖抑制作用,可以提高细胞表面HLA-A,B,C分子的表达和c-fos蛋白的表达,抑制bcl-2基因的表达,提高CD3AK细胞对PG细胞的杀伤活性。结论:ICA,PJM可以逆转肿瘤恶性表型,提高免疫效应细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。     

体外诱导的粘蛋白抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞抗乳腺癌的研究

目的 制备携带粘蛋白(MUC1)抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/MUC1),研究其感染树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤肿瘤细胞的活性.方法 应用分子生物学方法制备高低度的重组腺相关病毒(AAV/MUC1).AAV/MUC1体外感染外周血单核细胞,诱导分化为DC.DC与T淋巴细胞混合,刺激产生CTL.流式细胞技术检测DC和CTL的分化和功能指标,MTS方法检测CTL的杀伤活性和特异性.结果 成功制备的重组病毒(AAV/MUC1)滴度为6×1010拷贝/ml.感染单核细胞率为84.27%.所获得的CTL对MUC1阳性的乳腺癌细胞株的杀伤率为(46.32±0.07)%.其杀伤作用具有MUC1抗原特异性和MHC-I类分子限制性的特征.结论 以MUC1抗原为靶点的CTL可有效地杀伤乳腺癌细胞,为乳腺癌提供了一条新的治疗途径.     

基础理论

云南省肿瘤医院2003～2006年恶性肿瘤住院病例构成比分析，树突状细胞激活效应细胞的最佳效靶比及其体外杀伤活性的研究，树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对多药耐药肿瘤细胞系的杀伤活性，PADRE／MUC4重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究，不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤活性的研究     

4-1BBL修饰小鼠结肠癌疫苗体外诱导抗肿瘤免疫反应的研究

背景与目的:研究4-1BBL(4-1BB Ligand,即CD137配体)转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)特异性杀伤活性及刺激淋巴细胞产生细胞因子的作用.材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKITneo/4-1BBL导入小鼠结肠癌colon26细胞,经G418筛选后获得4-1BBL高表达克隆,用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗,与经体外诱导的同系小鼠CTL共同培养,测定对CTL特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子(IL-2、IL.-4和IFN-γ)的影响.结果:转染4-1BBL的colon26细胞高表达4-1BBL蛋白,将该细胞经MMC处理后制成的瘤苗,与野生型colon26细胞相比,对CTL特异性杀伤亲本肿瘤细胞的作用明显增强(P＜0.01),但CTL对非亲本肿瘤细胞的杀伤作用无明显影响(P＞0.05);该瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的能力(P＜0.01).结论:4-1BBL转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗能有效诱导抗结肠癌免疫反应.     

白细胞介素和肿瘤免疫治疗

在肿瘤免疫治疗中,提高抗肿瘤活性的特异细胞毒 T 杀伤细胞(Specific CytotoxicT Lymphocytes,CTL)和其它具有杀伤功能的细胞的活性是至关重要的,并且已发现某些免疫促进剂或药物具有诱导 CTL 和 NK 细胞活性的作用,但是它们往往不能够成为对肿瘤有明显抑制效应的免疫杀伤细胞。此外有许多种类的肿瘤细胞并不具有免疫原性,这些条件限制了它们在肿瘤治疗中对癌细胞的杀伤效果。     

EBV-LMP2多肽所激活的特异性CTL对鼻咽癌细胞杀伤活性的研究

[目的]研究EB病毒编码的LMP2多肽片段所激活的肿瘤特异性CTL对鼻咽癌细胞的杀伤作用,探讨利用LMP2多肽对鼻咽癌进行免疫治疗.[方法]通过细胞免疫方法鉴定鼻咽癌细胞(CNE2)中的LMP2蛋白是否表达;外周血分离树突状细胞(DC)体外培养,以LMP2多肽片段负载DC激活产生特异性CTL;通过流式细胞仪、MTT法检测特异性CTL对CNE2细胞杀伤活性.[结果]在CNE2中表达LMP2蛋白,LMP2多肽所激活的肿瘤特异性CTL对鼻咽癌细胞具有杀伤活性.[结论]LMP2多肽片段所激活的肿瘤特异性CTL在体外对鼻咽癌细胞具有杀伤作用.     

联合应用新城疫病毒及其 HN基因对小鼠黑色素瘤抑制效应的研究

背景与目的:尽管新城疫病毒( Newcastle disease virus, NDV)对多种肿瘤具有抑制作用 ,但其抑瘤机制尚不完全清楚.以前的研究结果表明,该病毒的血凝素神经氨酸酶( hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因在该病毒的抗肿瘤作用上发挥重要作用且 HN蛋白表达后能够定位于肿瘤细胞膜上,以 HN蛋白作为肿瘤细胞的外源抗原来研究其抑瘤作用尚未见报道.本研究拟探讨 HN蛋白作为外源抗原在新城疫病毒抗肿瘤的作用以及二者联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应.方法:在 C57BL/6小鼠右后肢皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 105个.荷瘤第 2天,左后肢肌肉注射含新城疫病毒 HN基因的重组质粒,荷瘤第 7天,瘤内注射新城疫病毒 2× 109pfu;同时设单独 HN基因或 NDV治疗组及注射 PBS的对照组.通过抑瘤率观察动物体内的抑瘤效果;通过特异性细胞毒 T淋巴细胞( cytotoxic T lymphocyte,CTL)实验, ICAM Ⅰ、 CD48及新城疫病毒 HN蛋白在肿瘤细胞表面表达检测,探讨 HN蛋白所介导的抑瘤作用.结果:联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因对肿瘤的抑制效果明显好于单独 HN基因及新城疫病毒,抑瘤率达 82.8%,特异性 CTL反应增强,对靶细胞的杀伤率为 18.4%;单独 HN基因及新城疫病毒治疗组的抑瘤率分别为 56.6%、 41.0%,特异性 CTL活性分别为 4.4%、 10.1%;瘤内注射 NDV的肿瘤细胞表面检测到 HN分子的表达, ICAM Ⅰ、 CD48分子表达上调.结论:定位于肿瘤细胞表面的 HN蛋白介导机体对肿瘤细胞的特异性杀伤,联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因显著增强了机体对肿瘤细胞的杀伤效应.     

IL-12协同B7-1诱导机体抗肿瘤免疫的实验研究

目的研究白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)协同共刺激分子B7-1,联合诱导机体抗肿瘤免疫对大鼠卵巢上皮癌的治疗作用并探讨其机理.方法用携带有小鼠IL-12和B7-1的逆转录病毒表达载体感染大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19,建立高表达细胞株NuTu-19/IL-12、NuTu-19/B7-1及双基因共表达细胞株NuTu-19/IL-12-B7-1,并以转染空载体pLXSN的细胞NuTu-19/Neo为对照.用经丝裂霉素C处理的各种基因修饰的肿瘤细胞免疫动物,观察卵巢癌腹腔转移模型动物生存期,及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)杀伤活性的作用.结果经各种基因修饰的肿瘤细胞免疫后,大鼠脾淋巴细胞增殖能力有不同程度的提高,CTL杀伤同源肿瘤细胞的活性明显增强,IL-12和B7-1基因联合修饰的肿瘤细胞免疫动物对模型动物生存期的延长具有显著意义(P＜0.05).结论IL-12和B7-1基因联合修饰的肿瘤细胞可以刺激机体CTL增殖、成熟,增强CTL对肿瘤细胞的识别和杀伤活性等,两者联合具有明显的协同效应.联合免疫基因治疗作为一种新的卵巢癌治疗方法,值得深入研究.     

树突状细胞与肿瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应

目的：研究树突状细胞（DC）与肿瘤细胞（SP2／0）融合作为肿瘤疫苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机理。方法：BALB／C小鼠DC与SP2／0细胞体外融合,形成的杂交瘤分2次免疫接种同基因小鼠皮下,然后用SP2／0细胞攻击免疫的小鼠,观察肿瘤的生长情况及免疫小鼠脾细胞特异性CTL功能。结果：DC－SP2／0杂交瘤接种小鼠能产生明显的抗肿瘤效应,其拮抗SP2／0细胞攻击的能力明显强于用灭活的死SP2／0细胞与DC混合,和单用死SP2／0细胞免疫的小鼠及用生理盐水的对照组小鼠。DC－SP2／0杂交瘤免疫接种小鼠的脾细胞特异性CTL杀伤活性强于其它各组小鼠。结论：DC与肿瘤细胞融合后作为肿瘤疫苗接种可在体内产生明显的抗肿瘤免疫,其机理主要是特异性CTL的作用。     

rIL-6抗癌机理初探(Ⅱ)-rIL-6对小鼠脾脏NK细胞和CTL细胞体内外调节效应

为了探讨rIL-6对NK和CTL细胞的调节效应．我们进行了rIL-6对小鼠脾脏NK细胞和CTL细胞功能影响的体内外实验研究，实验采用C57BL/6荷瘤或正常小鼠，给予rIL-6或生理盐水，连续10天，第15天取小鼠脾脏进行NK细胞或CTL细胞的活性测定。结果表明：(1)rIL-6在体外对NK细胞在小剂量时有促进作用，在大剂量时有抑制作用；对CTL细胞则表现出随IL-6剂量的增加，促进作用明显增强；(2)rIL-6对正常鼠体内NK细胞杀伤活性有促进怍用；(3)对荷瘤鼠体内NK细胞和CTL细胞杀伤活性均有明显的促进作用；(4)rIL-6对荷瘤所致NK功能下降具有预防作用。提示rIL-6对小鼠NK细胞和CTL细胞杀伤活性的促进效应可能是rIL-6发挥抗癌作用的一个途径。     

小鼠实体瘤中IFN-γ和TNF依赖的ALV旁观清除

肿瘤细胞表达特异性抗原,被CTL识别并靶向杀伤,但肿瘤仍可通过多种机制逃逸机体免疫系统的杀伤.肿瘤微环境中基质细胞在肿瘤生长过程中并不是旁观者,可调控肿瘤的生长,是肿瘤免疫逃逸的重要机制.因此,靶向基质可治疗肿瘤.肿瘤抗原缺失体(antigen loss variants,ALV)是肿瘤遗传不稳定性形成的抗原缺失肿瘤细胞群体,不能被CTL识别和杀伤.因此,ALV是肿瘤免疫逃逸的重要机制,也是免疫治疗肿瘤的主要障碍.     

拓扑替康促人卵巢癌顺铂耐药细胞株凋亡机制的初步研究

目的探讨拓扑替康(TPT)对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP的杀伤和诱导凋亡活性及其作用机制.方法用MTT比色法测定TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP的杀伤效应;透射电镜和DNA凝胶电泳研究TPT对靶细胞的凋亡诱导活性;Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达.结果TPT对A2780/DDP和COC1/DDP细胞均有较强的体外杀伤作用,其IC50值分别为102.91 ng/ml和111.75 ng/ml;TPT能诱导A2780/DDP和COC1/DDP细胞产生凋亡,DNA凝胶电泳呈现典型的凋亡梯度,透射电镜观察到细胞核染色质固缩、边集,胞质浓缩,出现空泡等典型的凋亡超微结构改变;TPT不影响bcl-2蛋白表达,却能上调bax蛋白表达,增大bax/bcl-2比值,且呈剂量依赖性.结论TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP均有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能与bax基因表达上调而提高bax/bcl-2比值有关.     

IL—2基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

目的：探讨小鼠接种腺病毒介导的IL－2基因转移的CT26小鼠结肠腺癌细胞后机体免疫功能的变化（包括CTL、LAK细胞、NK细胞、巨噬细胞的杀伤活性变化）。方法：体外将腺病毒介导的小鼠IL－2基因转染CT26细胞（CT26-mIL-2)，然后将CT26－mIL2细胞接种于小鼠皮下。采用4h乳酸脱氢酸释放法检测荷瘤小鼠CTL、LAK、NK细胞的杀伤活性，MTT法检测巨噬细胞的杀伤活性。结果：接种CT26－mIL－2后第14d，小鼠脾细胞NK活性和诱导后的LAK活性和CTL活性均显著高于对照组（P＜0．01）；小鼠腹腔巨噬细胞数量显著增加，杀伤活性显著增强（P＜0．01）。结论：IL－2基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能参与机体的抗肿瘤作用。     

人细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞及诱发凋亡的实验研究

目的　测定特异性细胞毒 T淋巴细胞 (CTL )对胃癌细胞的体外杀伤活性及观察形态学改变。方法　用分离胃腺癌患者的癌细胞经丝裂霉素 C处理后 ,作为抗原与抗CD3单克隆抗体、重组白细胞介素 - 2刺激患者自体外周血单个核细胞 ,体外诱导 CTL,用 MTT比色法测定 CTL 对自体癌细胞、人胃癌细胞株 (BGC- 82 3和 MGC- 80 3)的体外杀伤活性。将 CTL与 BGC- 82 3共同温育 ,通过透射和扫描电镜观察杀伤靶细胞的形态改变。结果　 CTL对自体胃癌细胞有特异性杀伤作用 ,可使靶细胞凋亡或溶解坏死。结论　体外混合细胞培养诱导出的 CTL,对靶细胞有明显的杀伤作用     

人νδT细胞细胞毒活性研究

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞的作用是机体抗瘤机制的重要环节，也是肿瘤过继免疫疗法中的主要效应细胞之一。因此寻找能特异杀伤肿瘤细胞的CTL是目前肿瘤生物疗法中急待解决的焦点之一。νδT细胞是T细胞的另一亚类，大量的实验表明：这群细胞与LAK，NK细胞相似，其胞浆中富含穿孔素，     

热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞体外刺激细胞毒T细胞活性比较

目的:比较热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞(dendritic cell,DC)体外刺激细胞毒T细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)的活性。方法:分别制备热休克诱导凋亡胃癌细胞株和肿瘤细胞冻融裂解物,同时分离12例胃癌患者外周血单核细胞体外诱导DC进行负载,并以两种不同方式负载的DC进行淋巴细胞增殖反应及CTL杀伤实验,比较其刺激淋巴细胞增殖及激活的淋巴细胞杀伤靶细胞能力的差异。结果:负载热休克胃癌细胞的DC与负载反复冻融肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞CTL活性,但前者的CTL活性显著高于后者(P<0.05)。结论:用热休克肿瘤细胞负载DC是一个更为有效的负载方式,为临床应用提供了一种可选择的负载方式。     

用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP2/O生长的比较研究

目的本研究旨在比较靶向bcl-2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2/O细胞生长的抑制作用.方法采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl-2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2/O细胞生长、bcl-2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用.结果检测结果证实bcl-2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl-2正义RNA对上述指标无显著增强作用.提示LdsRNA对bcl-2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗.     

热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞体外刺激细胞毒T细胞活性比较

目的：比较热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞（dendritic cell,DC）体外刺激细胞毒T细胞（cytotoxic Tlymphocyte,CTL）的活性。方法：分别制备热休克诱导凋亡胃癌细胞株和肿瘤细胞冻融裂解物,同时分离12例胃癌患者外周血单核细胞体外诱导DC进行负载,并以两种不同方式负载的DC进行淋巴细胞增殖反应及CTL杀伤实验,比较其刺激淋巴细胞增殖及激活的淋巴细胞杀伤靶细胞能力的差异。结果：负载热休克胃癌细胞的DC与负载反复冻融肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞CTL活性,但前者的CTL活性显著高于后者（P〈0.05）。结论：用热休克肿瘤细胞负载DC是一个更为有效的负载方式,为临床应用提供了一种可选择的负载方式。