G蛋白耦联受体激酶结合蛋白1通过调节细胞外调节激酶1/2的活性促进成骨细胞迁移

目的探索G蛋白耦联受体激酶结合蛋白1(GITI)在成骨细胞迁移中的作用,并分析其机理。方法通过Western blot方法检测GIT1蛋白在鼠的成骨细胞内的表达；用免疫荧光染色方法确定：在血小板衍生生长因子(PDGF)不刺激和刺激的条件下,GIT1和细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)在成骨细胞内的位置；用共同免疫沉淀的方法测定GIT1和ERK1/2相互结合,并且用免疫荧光双染的方法确定这两种蛋白相互结合的位置；用包含GIT1-RNA发夹结构的腺病毒感染成骨细胞后,用免疫荧光染色方法确定磷酸化ERK1/2(pERK1/2)在成骨细胞内的位置,用划痕愈合法检测在PDGF刺激下的迁移能力。结果在成骨细胞内,PDGF刺激导致了GIT1和ERK1/2的相互结合,并且这种结合发生在成骨细胞的局部粘附内。包含GIT1-RNA发夹结构的腺病毒明显抑制了pERK1/2招募至成骨细胞局部粘附内以及PDGF所刺激的成骨细胞的迁移。结论在PDGF刺激下,GIT1招募pERK1/2至成骨细胞的局部粘附内,从而促进成骨细胞的迁移。     

G蛋白偶联受体激酶的临床应用前景

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)的功能主要是参与GPCRs的同源脱敏,终止GPCRs介导的信号转导通路.此外GRKs还通过其他多种机制调节机体的生理功能.GRKs几乎存在于所有动物细胞中,有广泛而复杂的调节网络.GRKs活性不足或亢进参与多种疾病的发生与发展,因此精确调节GRKs具有重要的临床应用价值.本文就GRKs的临床应用价值及针对GRKs调节网络及干预方法的研究的最新进展作一综述.     

G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶活性的影响

目的 探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GITl)的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶(FAK)活性的影响,并分析其机制.方法 取1～2dSD大鼠颅盖骨进行成骨细胞原代培养,传至第3代.体外构建野生型GIT1和删除了SHD结构域的GIT1的质粒并组成慢病毒.血小板衍生生长因子(PDGF)刺激成骨细胞后,采用免疫共沉淀法检测GIT1、删除了SHD结构域的GIT1与FAK的相互关系,采用免疫荧光法检测GIT1和FAK在成骨细胞内的位置、删除了SHD结构域的GIT1对成骨细胞内FAK位置和活性的影响.结果 PDGF刺激成骨细胞后,GIT1与FAK的相互结合明显增加,且随着时间的增加,结合量逐渐增加(F=293.105,P=0.000).免疫荧光染色结果表明:PDGF刺激后,成骨细胞局部黏附内活性形式的FAK(FAK酪氨酸397磷酸化)明显增加.PDGF刺激成骨细胞后,删除了SHD结构域的GIT1与FAK的结合明显被抑制,且随着时间的增加,二者的相互关系无明显变化(F=0.322,P=0.737);删除了SHD结构域的GIT1抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化,同时降低FAK在局部黏附内的表达.结论 删除了SHD结构域的GIT1通过降低与FAK的相互结合,从而抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化,影响成骨细胞的功能.     

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1对BMSCs向内皮细胞分化的影响机制研究北大核心CSCD

目的通过比较G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型及GIT1基因敲除型小鼠BMSCs向内皮细胞分化过程,探讨GIT1影响血管形成的机制。方法 GIT1杂合子小鼠雌雄配对饲养,对获得的新生小鼠采用PCR法行基因型鉴定。取GIT1野生型与GIT1基因敲除型小鼠胫骨及股骨,分离培养BMSCs并传代。取第2代BMSCs分为4组,分别为野生型对照组(A组)、野生型实验组(A1组)、基因敲除型对照组(B组)、基因敲除型实验组(B1组);A1、B1组细胞采用内皮细胞诱导液培养,A、B组细胞进行常规培养。Western blot检测各组细胞VEGF受体2(VEGF receptor 2,VEGFR-2)、VEGFR-3、磷酸化VEGFR-2(phospho-VEGFR-2,p VEGFR-2)、p VEGFR-3蛋白表达;流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)、血小板内皮细胞黏附因子1(platelet-endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1)、血管内皮黏钙蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-Cadherin)表达。另取GIT1野生型小鼠第2代BMSCs分为4组:Ⅰ组,原细胞培养液培养;Ⅱ组,细胞培养液中加入VEGFR-3阻断剂SAR131675;Ⅲ组,内皮细胞诱导液培养;Ⅳ组,内皮细胞诱导液中加入SAR131675。流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物v WF、PECAM-1、VE-Cadherin表达。结果 Western blot检测示,A、A1、B、B1组细胞的VEGFR-2、p VEGFR-2蛋白表达无明显差异,A1组VEGFR-3、p VEGFR-3蛋白表达明显高于其余3组。流式细胞仪检测示,A1组v WF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于A、B、B1组,B1组显著高于A、B组(P<0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。阻断VEGFR-3实验中,Ⅲ组v WF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组,Ⅳ组高于Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GIT1通过VEGFR-3影响小鼠BMSCs向内皮细胞分化,进而影响血管形成。     

G蛋白偶联受体激酶-5调控前列腺肿瘤的生长

肿瘤治疗的局限性很大程度归因于肿瘤在治疗过程中对传统细胞毒性化疗的抵抗。因此,需要更加深入的认识影响肿瘤形成的信号分子和通路,从而拓宽肿瘤治疗的选择性。G蛋白受体激酶起初以其在G蛋白偶联受体信号调控中的保守作用被人们所认知,如今已成为另外一些生物分子及功能的调节因子。     

磷酸化细胞外信号调节激酶1/2定位于成骨细胞的局部黏附时需要Src活性

目的探讨血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)刺激成骨细胞,对磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase1/2,pERK1/2)位置的影响。方法出生3d清洁级健康小鼠10只,雌雄不拘,体重6～9g。取小鼠颅骨,分离培养原代成骨细胞。取第6代成骨细胞,1%血清培养液培养12h后,随机分成经10μmol/L PP2处理30min组(实验组)和未处理组(对照组),每组再随机分成2个亚组:其中一组用PDGF(20ng/ml)刺激10min,另一组不用PDGF刺激,采用免疫组织化学染色检测pERK1/2分布。另取第6代成骨细胞,当细胞生长至80%融合时,用细胞刮随机分成2组,一组用10μmol/L PP2预处理30min(实验组),另一组不用PP2作用(对照组),再用20ng/ml PDGF培养12h,采用划痕愈合法检测PP2对成骨细胞在PDGF刺激下迁移能力的影响。另取第6代成骨细胞,调整细胞浓度1×106/ml,随机分成2组,分别经DMSO(对照组)和10μmol/L PP2(实验组)预处理30min,每组再随机分成2个亚组:其中一组用PDGF(20ng/ml)刺激10min,另一组不用PDGF剌激,采用Western blot检测细胞骨架蛋白内pERK1/2活性。结果免疫荧光染色结果显示,PDGF促进pERK1/2定位于成骨细胞的局部黏附和细胞核内;而PP2显著抑制了由PDGF刺激引起的pERK1/2定位于成骨细胞的局部黏附,但并不影响pERK1/2定位于细胞核内。细胞划痕愈合实验显示,PP2明显抑制了由PDGF所诱导的成骨细胞迁移。Western blot检测结果显示,PP2明显抑制了由PDGF所诱导的成骨细胞局部黏附内ERK1/2的磷酸化。结论PDGF通过激活Src活性,促进pERK1/2定位于成骨细胞的局部黏附内;PP2通过抑制pERK1/2定位于成骨细胞的局部黏附,从而抑制由PDGF所诱导的成骨细胞迁移。     

G蛋白偶联的雌激素受体在雄性生殖中的作用

G蛋白偶联的雌激素受体(GPER),又称G蛋白偶联受体30(GPR30),是近年来发现的有别于雌激素经典核受体的功能性膜受体。该受体广泛表达于皮质、小脑、海马、心脏、肺、肝脏、骨骼肌及泌尿生殖器官等全身各个系统,与雌激素及其相关的衍生物结合,引起快速的非基因效应,参与全身各个系统的多种生理活动。本文主要对男性生殖中GPER的分子结构、亚细胞定位、信号传导、分布以及功能进行了综述。     

G蛋白偶联受体30介导的雌激素信号转导在雄性生殖系统中的研究进展

雌激素是人体内一种极其重要的类固醇激素,在心血管系统、运动系统、免疫系统和中枢神经系统等均发挥着重要的生物学作用,尤其在生殖细胞中的作用更为关键[1-4],雌激素的缺乏和过量可造成多种疾病的发生.雌激素是一种脂溶性化合物,可自由扩散进入细胞,雌激素的生理作用通过与其特异性受体雌激素受体(estrogenreceptors,ERs)结合而实现.     

氯胺酮对新生大鼠海马区G蛋白偶联受体30表达的影响

目的探讨氯胺酮对新生大鼠海马区G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)表达的影响。方法实验一:随机选取20只健康雄性SD大鼠作为空白对照组(S组,n=20),在饲养1、3、7、14 d时各取出5只处死,采用免疫组化法检测大鼠海马区GPR30阳性细胞数。实验二:10只出生7 d健康雄性SD大鼠随机分为两组,生理盐水组(C组,n=5)和氯胺酮组(K组,n=5)。连续3 d腹腔注射生理盐水0.1 ml(C组)或氯胺酮75 mg/kg(K组),在末次给药后24 h处死,采用免疫组化法检测大鼠海马区cleaved caspase-3阳性细胞数,采用Western blot法检测海马区GPR30蛋白含量。结果与1 d和3 d比较,7 d和14 d S组大鼠海马区GPR30蛋白含量明显升高(P0.05);与7 d比较,14 d时S组大鼠海马区GPR30蛋白含量明显升高(P0.05)。与C组比较,K组海马区cleaved caspase-3阳性细胞数明显增多,GPR30蛋白含量明显降低(P0.05)。结论氯胺酮诱导发育期大鼠海马细胞凋亡可能与GPR30表达下调有关。     

运动调控骨代谢的关键膜上受体—G蛋白偶联受体48

G蛋白偶联受体48(GPR48)作为一富含亮氨酸重复序列的膜上七次跨膜受体,其LRR结构域与R-spondin1或Norrin结合形成复合体后可作用于下游关键因子可调控骨质疏松、阿尔茨海默病、高血压等疾病发生。骨作为重要的生理学和生物力学组织,由成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)分别主导的骨形成和骨吸收之间的拮抗及协同调控骨组织代谢平衡。骨细胞是力学刺激敏感细胞,调节应力加载后的骨适应性反应,而运动训练对骨产生的力学刺激可翻译成结构级联性生化反应(Wnt、c AMP/PKA/Atf4、OPG/RANKL/RANK等途径稳态表达),调控骨形成和/或骨吸收。并且,GPR48通过R-spondin1可直接调控以上信号途径的激活状态。那么,GPR48能否通过下游级联信号途径从而在运动影响骨代谢中起分子介导作用呢?探究GPR48在运动影响骨代谢中的作用及其分子介导机制,希望能进一步完善运动影响骨代谢的分子机制信号网络并为骨疾病诊治提供新靶点和非药物干预方式。     

IFN-γ抑制兔耳创面瘢痕形成中PTK活性变化

目的:观察在兔耳创面愈合前后使用IFN-γ对瘢痕形成的影响并检测瘢痕组织中PTK活性的变化,探讨二者间的关系。方法:在兔耳腹侧伤口愈合前(A组)和后(C组)以及连续使用IFN-γ(B组),观察瘢痕形成情况并测定正常兔耳皮肤、创面上皮化时(12-14天)及其后3天、7天、14天和21天时瘢痕组织中PTK活性变化。结果:A、B和C组瘢痕组织中PTK活性变化规律与对照侧相同:上皮化后活性均逐渐升高,和正常皮肤组织比较(P<0.001),21天时基本恢复正常皮肤的水平;各组的处理侧在3天和7天时以及A、B组上皮化时PTK活性高于对照侧(P<0.05)。IFN-γ能抑制瘢痕增生,以A组和B组作用最强(P<0.05)。结论:创伤愈合后瘢痕组织中PTK活性升高提示PTK介导的信号可能参与瘢痕改建过程。不同时期使用IFN-γ能进一步活化PTK并显著抑制瘢痕增生意味着IFN-γ的抑制作用可能经活化PTK介导。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF受体胎肝激酶1表达的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后VEGF受体胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，Flk-1）基因和蛋白表达的影响，探讨BMSCs移植修复大鼠SCI的机制。方法取4周龄雄性Wistar大鼠5只，体重100～120g，进行BMSCs分离及培养。取81只Wistar雌性大鼠，体重220～250g，采用改良Allen’s打击装置制备SCI模型，随机分为3组：假手术组（A组，n=21），仅咬除T8～10棘突和椎板；DMEM组（B组，n=30），SCI区周围注射DMEM；BMSCs组（C组，n=30），SCI区周围注射BMSCs。于移植术后1、3、5d，采用RT-PCR方法检测各组大鼠SCI区Flk-1基因表达的变化；于移植术后3、7、14d，免疫组织化学方法观察脊髓内Flk-1蛋白的表达。结果原代培养的BMSCs细胞形态多样，随着传代次数的增加，细胞形态逐渐趋于均一，多为扁平形和长梭形。RT-PCR结果显示，在移植术后1、3、5d，C组Flk-1 mRNA表达水平与B组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；但B、C组与A组比较，Flk-1 mRNA表达于术后1d明显增加并达峰值（P〈0．01），术后3d下降（P〈0．0.01），至术后5d表达仍高于A组（P〈0．05）。免疫组织化学结果显示，移植术后3、7d，B组Flk-1蛋白表达较A组显著增加，差异有统计学意义（P〈0．01）；术后14d，A、B组Flk．1蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）；移植术后3d，B、C组Flk-1表达相似，差异无统计学意义（P〉0．05），移植术后7、14d，C组Flk-1表达明显高于B组（P〈0．0.01）。结论SCI后BMSCs移植对Flk-1 mRNA的表达无调节作用，但上调Flk-1蛋白的表达，是修复SCI的机制之一。     

蛋白激酶C在TGF-β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成中的介导作用

目的:研究蛋白激酶C(PKC)在TGF-β1刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(HS-FB和NS-FB)增殖和合成胶原中的信号转导作用。方法:利用32P掺入底物法测定PKC活性;MTT法测定增殖能力,3H-脯氨酸掺入法测定胶原合成能力。结果:TGF-β1刺激后NS-FB和HS-FB中PKC的活性逐渐升高,刺激120min时尚未恢复(30min后P<0.05),GF109可阻断TGF-β1活化PKC。TGF-β1和PKC活化剂(含磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油和Ca2+)都可刺激NS-FB和HS-FB增殖和合成胶原(P<0.05);而GF109则有抑制作用(60min后P<0.05)且能部分阻断TGF-β1的刺激作用。结论:活化PKC能刺激NS-FB和HS-FB增殖和合成胶原,而抑制PKC活化仅部分阻止细胞增殖。TGF-β1的刺激作用部分经PKC通道转导。