臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根GAP-43 mRNA表达

目的：探讨臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达变化及其影响因素,为臂丛损伤的修复治疗提供理论依据.方法：本实验创立三种臂丛根性撕脱伤模型：C7前根撕脱（Ⅰ组）;C7前根撕脱＋切断同侧C5～T1后根（Ⅱ组）;C7前根撕脱＋C5和C6之间作同侧脊髓半横断（Ⅲ组）.术后2周按CBS评分标准检查动物神经缺失症状,用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达改变.结果：根据CBS评分标准,对照组计为0分,Ⅰ组计分较低、Ⅲ组计分最高.对照组C7神经元胞体和C7神经根中GAP-43 mRNA表达量相近,但三种损伤组术后2周神经元胞体内GAP-43 mRNA表达均上调,而神经根内表达却下调.结论：（1）臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体GAP-43 mRNA表达受突触前机制的调控;（2）臂丛损伤2周时神经元胞体内GAP-43 mRNA表达呈现高峰期,此时进行神经移位术将显著提高神经修复的效果.     

外源性一氧化氮对臂丛根性撕脱伤后脊髓的影响

目的探究在根性撕脱伤早、中期应用外源性一氧化氧(NO)供体硝普钠补充NO能否改变撕脱伤诱导运动神经元的凋亡进程及其相关机制。方法成年SD大鼠,右侧全臂丛神经根撕脱后于4 d和13 d分别在蛛网膜下腔受损脊髓节段局部给予NS或5 mmol/L SNP各4μL,存活2d后处死。取C7节段脊髓应用免疫组织化学以及酶组织化学、中性红染色、Western blot等方法,定量存活运动神经元数以及nNOS蛋白在运动神经元的表达情况;同时检测i NOS、GFAP、0X-42在胶质细胞的表达情况。结果 SNP 40 mmol/L以上剂量局部应用会导致动物立刻死亡,我们选择了5 mmol/L做为最终SNP浓度;SNP会降低撕脱伤脊髓运动神经元的存活率(%)6 d时间点SNP组与NS组无显著差异;15 d时间点,SNP组(57.41±3.96)显著低NS组(81.48±2.53);撕脱伤引起的小胶质细胞和星形胶质细胞反应与NS组相比加剧。结论在早期补充NO使前角运动神经元nNOS表达时间提前;加剧损伤脊髓的胶质反应;使运动神经元死亡时间提前,死亡程度增加。     

神经根撕脱后脊髓运动神经元的病理表现

目的:观察神经根撕脱后脊髓前角运动神经元的病理表现,探讨在该条件下运动神经元死亡的神经生物学机制。方法:选择成年SD雌性大鼠20只,体重200-300g,撕脱右侧臂丛C₅-T₈神经根,术后动物存活3d、5d、1周后取C₅-C₈节段脊髓,对冰冻切片行NADPH-d组化、c-jun免疫组化、中性红和HE染色。观察神经元的形态,计数脊髓前角NOS阳性运动神经元及存活运动神经元数目,以非损伤侧的前角运动神经元数目为100%,计算百分比。结果:神经根撕脱3d、5d、1周后,损伤侧脊髓前角NOS运动神经元平均阳性率分别为:0.74%±0.59%、24.83%±6.73%、51.16%±8.67%。神经元平均存活率分别为93.00%±4.32%、93.67%±5.27%、89.83%±2.65%;c-Jun从撕脱术后3d就有表达,5d后表达开始减少。运动神经元形态变化不明显。1周时偶见前角运动神经元的胞核偏位,但核膜清晰,核仁尚存,染色体固缩。结论:脊神经根撕脱1周内,脊髓前角运动神经元NOS表达递增,c-Jun表达递减,运动神经元开始死亡。NO/NOS可能通过抑制神经元损伤后的再生反应,促进脊髓前角运动神经元的死亡。     

臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠(6～8周龄)在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段(C7、C8)磷酸化CaMKⅡ在1、2、3 d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1 d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2 d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示:臂丛根性撕脱伤后1 d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达,但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1 d时高表达,然而在3 d时逐步下降到正常水平。     

臂丛损伤后脊髓前角运动神经元超微结构改变

目的探讨大鼠臂丛损伤导致脊髓前角运动神经元死亡的机制。方法成年雄性SD大鼠24只,其中对照组6只,损伤组18只。建立3种臂丛损伤模型:右C7前根撕脱(A组);右C7前根撕脱+同侧C5～T1后根离断(B组);右C7前根撕脱+右C5与C6之间脊髓半横断(C组)。术后14d取C7节段脊髓,采用尼氏染色方法和透射电镜技术,观察脊髓前角运动神经元的存活率及其超微结构改变。结果术后2周A组脊髓前角运动神经元的存活率最高,B组居中,C组最低。3个臂丛损伤组C7前角均可见凋亡特征性改变:运动神经元内核染色质聚集靠边,核固缩、碎裂、核膜皱褶并内陷,并有染色质团块形成的凋亡小体。细胞体积缩小,胞浆内细胞器密集,线粒体轻度肿胀,核周粗面内质网减少,游离核糖体增多,胞浆内可见较多的空泡。神经元胞体周围的有髓神经纤维和无髓神经纤维呈轻度肿胀,髓鞘的板层结构消失。结论臂丛损伤诱导脊髓运动神经元死亡途径中存在凋亡和坏死两种机制,运动神经元可形成凋亡小体。     

臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠（6-8周龄）在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段（C7、C8）磷酸化CaMKⅡ在1、2、3d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示：臂丛根性撕脱伤后1d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达。但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1d时高表达,然而在3d时逐步下降到正常水平。     

热休克蛋白27对臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元NOS的影响

目的:观察热休克蛋白27(Hsp27)对大鼠臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元一氧化氮合酶(NOS)表达的影响.方法:Wistar大鼠60只,随机分为实验组和对照组.实验组动物分别以45℃预处理热处理15 min,再置于42℃维持20min,置室温恢复24 h后,手术显微镜下进行脊髓C5～C8节段神经根撕脱术;对照组仅施行臂丛神经根撕脱术,两组分别于术后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d处死动物.各组取C5～C8节段脊髓,行Hsp27免疫组化、NADPH-d组化染色,结合自动图象分析系统对结果进行半定量分析.结果:①实验组在12 h即有NOS大量表达,之后迅速同落;对照组伤后第5天开始大量出现NOS阳性.②两组Hsp27表达高峰均在热休克后1 d,且实验组强于对照组.结论:臂丛神经根撕脱伤后Hsp27可能通过抑制NOS神经元来发挥其细胞保护作用.     

电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管nNOS蛋白表达的影响

目的采用电针疗法干预大鼠臂丛神经撕脱伤模型,探索电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管n NOS蛋白表达的影响。方法健康、雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只,行臂丛神经根性撕脱手术,随机分为撕脱伤组(AV组)和撕脱伤加电针治疗组(AV+EA组),AV+EA组动物隔日接受大椎(DU4)和手三里(LI10)电针治疗直至处死,每次治疗的输出脉冲波形为非对称双向疏密波,以20 Hz频率不间断治疗15 min。动物存活1周、2周、3周、6周处死,选取C7节段脊髓,行NADPH-d酶组织化学染色和中性红复染。结果脊髓后角,在AV组n NOS的微量表达;在AV+EA组2~3周n NOS在健侧的表达比伤侧增多,至6周脊髓后角n NOS阳性神经元表达AV组损伤侧;AV+EA组n NOS阳性神经元的表达与同时期的AV组。结论电针疗法导致脊髓后角及中央管n NOS阳性神经元的时空表达特异性。     

大鼠臂丛前根撕脱延期再植回对运动神经元存活的作用

目的：建立大鼠臂丛前根撕脱延期再植回模型，研究脊髓前角运动神经元的存活与再生。方法：采用FB逆行示踪法结合NADPH—d组化法与中性红复染，计数阳性神经元．结果：前根撕脱延期3、7、14d再植回组，动物存活3周及6周，脊髓前角运动神经元的存活率分别为79％和75％、58％和51％、57％和50％；NOS阳性神经元的表达率分别为18％和13％、30％和8％、20％和7％。仅做前根撕脱组动物，脊髓前角运动神经元存活率为41％和29％，NOS阳性神经元的表达率为55％和58％。结论：前根撕脱延期再植回能促进脊髓前角运动神经元的存活与再生。     

条件性损伤的时间与频次对神经根撕脱伤后脊髓前角运动神经元死亡及NOS表达的影响

目的　探索条件性损伤 (CL)的时间和频次对神经根撕脱 (TL)后脊髓前角运动神经元一氧化氮合酶 (NOS)表达及细胞死亡的影响。方法　成年SD雌性大鼠 116只 ,体重 2 0 0～ 30 0g ,以钳夹神经干为CL ,分为两个系列。时间系列 :在CL后 1d、3d、1w、2w后进行TL ,频次系列分别在 1w和 2w内行 1次、2次、6次钳夹 ,术后不同时间点处死动物 ,以单纯撕脱臂丛为对照 ,取C5～C8节段脊髓 ,行NADPH d组化染色 ,中性红复染。定量观察前角运动神经元NOS表达及神经元数目。结果　单纯撕脱组术后第 5d脊髓前角运动神经元开始表达NOS ,术后 3wNOS阳性神经元数达到高峰 ,随后逐渐下降并伴有神经元丢失。时间系列 :撕脱后 3d和 2w ,CL与TL间隔 1d组的NOS表达和神经元数目与对照组无显著性差异 ,但 3d、1w、2w组的NOS细胞数及神经元的丢失均较对照组明显 (P <0 0 5P <0 0 1) ,但在撕脱后 4w各CL时间的NOS表达和神经元存活均较对照组减少 (P <0 0 5 )。频次系列 :在 1w和 2w内增加CL次数可使NOS的表达水平和神经细胞的死亡数目有显著增加 ,在撕脱后 2w和 4w等较后的时间点更为明显 ;但在一定时间内 2次与 6次钳夹之间则无显著性差异。结论　条件性损伤与二次损伤之间的间隔影响撕脱后神经元NOS表达和神经元的死亡 ,以间隔时间     

MicroRNA在建立DJ-1基因敲减细胞模型中的应用

 目的 与传统的siRNA方法建立基因敲减模型不同,探讨合成microRNA(miRNA)在DJ-1基因敲减细胞模型中的应用。方法 构建针对DJ-1基因的合成miRNA载体,合成DJ-1基因的siRNA干扰片断。在脂质体介导下,将上述两种小干扰RNA载体或片断分别转染MN9D细胞系,应用real-time PCR和Western blots检测目的基因DJ-1的mRNA和蛋白表达。结果 与Control组相比,转染合成microRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调90%（p<0.05）,蛋白水平下调70%~85%(p<0.05);而转染siRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调50%~70%（p<0.05）,蛋白水平下调20%~50%（p<0.05）。结论 microRNA与siRNA均可作为基因敲减的重要研究手段。与传统的siRNA相比,合成microRNA对目的DJ-1的干扰效率更为显著。     

脊髓损伤模型大鼠神经修复与法舒地尔和RhoA基因沉默的干预

背景：研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。 目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔及RNA干预介导的RhoA基因沉默对脊髓损伤大鼠在体神经损伤修复的作用。 方法：雄性SD大鼠60只半切法制成脊髓半横断模型,随机等分成对照组、法舒地尔组和RhoA siRNA组。法舒地尔组于腹腔注射10 mg/kg法舒地尔,2次/d,连续用药1周;RhoA siRNA干扰组将RhoA siRNA表达质粒注射于大鼠脊髓损伤区。 结果与结论：伤后4周,法舒地尔和RhoA siRNA组大鼠后肢运动功能均有明显恢复,可见少量神经轴索样结构,辣根过氧化物酶阳性神经纤维数增多(P < 0.05),体感诱发电位的潜伏期明显缩短、波幅显著增强(P < 0.05)。提示大鼠脊髓损伤后给予Rho激酶抑制剂法舒地尔及RNA介导的RhoA基因沉默能够促进受损伤的脊髓神经功能恢复。     

天然抗氧化剂减少神经根撕脱诱导的一氧化氮合酶表达和运动神经元死亡

为了研究抗老年性痴呆 990 1号和 TA990 1+银杏叶标准提取物合剂对臂丛神经根撕脱后前角运动神经元的神经元型一氧化氮合酶 ( n NOS)表达和存活的影响 ,用成年 SD雌性大鼠进行右侧臂丛 C5～ T1 神经根撕脱术后 ,随机分为撕脱组、撕脱 +TA990 1组以及撕脱 +TA990 1和 EGb761合剂组。对此三组每天分别进行腹腔注射 1ml生理盐水、0 .5 % TA990 1、0 .5 %TA990 1和 EGb761合剂。治疗 5 d、1、2、4和 6周后处死动物并进行 NADPH-d染色及中性红复染。定量比较各组 n NOS阳性和存活的运动神经元数量。结果证明 ,神经根撕脱后 5 d受损运动神经元开始表达 n NOS,2周时达高峰 ,随后下降至 6周。受损运动神经元的死亡从 2周开始 ,4～ 6周最明显。抗氧化剂治疗组 n NOS表达规律与对照组相似 ,但是阳性程度和阳性细胞数量均少于对照组 ,存活的运动神经元数量则明显多于对照组。撕脱后 4～ 6周 ,TA990 1治疗组抑制 n NOS表达和提高运动神经元存活的效果均明显优于 TA990 1和 EGb761合剂组。结论 :天然抗氧化剂可有效地减少臂丛神经根撕脱后 n NOS表达 ,提高受损运动神经元的存活。 TA990 1抑制 n NOS表达的作用强于 EGb761。     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

siRNA干扰Notch1抑制肺癌干细胞脊柱转移瘤的生长

目的研究Notch受体1(Notch receptor 1,Notch1)在肺癌脊柱转移瘤中的表达,并探讨Notch1 siRNA对肺癌干细胞(lung cancer stem cells,LCSCs)迁移能力和脊柱转移瘤生长的影响。方法通过Western blotting法检测Sox2、Oct4和Notch1蛋白在肺癌脊柱转移瘤组织中的表达水平。通过lipofectamine 2000将Notch1 siRNA转染到肺癌干细胞(A549-CSC),Transwell法检测Notch1 siRNA对A549-CSC迁移能力的影响;将BALB/C裸鼠分为两组:control siRNA组和Notch1 siRNA组,分别通过左心室注射control siRNA和Notch1 siRNA转染的A549-CSC,通过Mic-CT检测小鼠脊柱转移瘤的生长。结果Western blot检测结果显示,Sox2、Oct4和Notch1蛋白在脊柱转移瘤组织中的表达显着高于癌旁对照组(P<0.01);Transwell结果显示,与control siRNA组比较,Notch1 siRNA组细胞迁移率显著降低(P<0.01);Mic-CT结果显示,与control siRNA组比较,Notch1 siRNA组小鼠脊柱转移瘤生长显著降低。结论siRNA干扰Notch1能够抑制LCSCs迁移能力,抑制小鼠肺癌脊柱转移瘤的生长。     

Expression of nitric oxide synthase and 27-kD heat shock protein in motor neurons of ventral root-avulsed rats

Root avulsion of adult spinal nerves causes the subacute cell loss of motor neurons. To explore the mechanisms of the elimination of motor neurons, we investigated the expression of two molecules--neuronal nitric oxide synthase (nNOS) as a cytotoxity marker and a 27-kD heat shock protein (HSP27) as a cytoprotection marker--in rat spinal motor neurons after ventral root avulsion, using immunofluorescent labeling technique for confocal laser microscopy. A drastic cell loss of motor neurons occurred during the first week following the avulsion, and the surviving motor neurons fell to approximately 60% of the control value at one week. Subsequent cell loss proceeded slowly, as the surviving motor neurons decreased to 35% at nine weeks. HSP27 immunohistochemistry showed that normal spinal motor neurons consisted of two types of motor neurons: HSP27-negative small motor neurons (< 500 micrometer2 ) (about 30%), and HSP27-positive large motor neurons (> 500 micrometer2) (about 70%). At one week, all of the HSP27-negative small motor neurons had died and only HSP27-positive large motor neurons survived. This event was followed by the induction of nNOS in the surviving large motor neurons, which showed a significant upregulation of HSP27. HSP27-negative small motor neurons were thus found to be more vulnerable to avulsion than HSP27-positive large motor neurons, suggesting that HSP27 may have protected the avulsed motor neurons from cell death. In addition, NO was involved in the gradual cell death of large motor neurons. The persistent upregulation of HSP27 and its colocalization with nNOS in surviving motor neurons may imply a keen competition in motor neuron survival between cytotoxic and cytoprotective systems.     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系 EGHC-9901 增殖的影响

 目的 建立稳定表达AFP-siRNA质粒的肝癌细胞系并探讨对其增殖的影响。方法 构建AFP-siRNA,用脂质体法转染肝癌细胞系,G418筛选4～5周,Western blot 及RT-PCR检测靶基因表达,分组：实验组,转染AFP-siRNA组;阳性对照组,转染空载体组;空白对照组,未处理组。MTT绘制生长曲线,平板克隆实验观察集落形成,流式细胞仪分析细胞周期。结果 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,实验组表达AFP近乎完全抑制;实验组增殖能力显著低于空载体组;实验组＞75μm集落形成数19±2,低于空载体组62±6;实验组G1期细胞数较空载体组提高20％左右。 结论 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,抑制AFP表达可使肝癌细胞发生G1期阻滞,明显抑制其增殖及集落形成能力。     

葛根素对臂丛根性撕脱后脊髓MMP-9蛋白表达的影响

目的　探讨大鼠臂丛根性撕脱后脊髓基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达变化以及葛根素对其表达的影响。 方法　成年雄性SD大鼠174只，随机分为正常组、模型组、葛根素低、中、高处理组。模型组和葛根素处理组行右侧C5~C7脊神经前根撕脱术，术后腹腔注射给药。Western Blot法检测C5~C7节段脊髓MMP-9蛋白的表达。 结果　与正常组比较，臂丛神经根性撕脱后1 d时MMP-9蛋白表达达高峰，3 d降至接近正常，1周后下降至较低水平。葛根素处理组脊髓组织MMP-9蛋白表达在1 d时比模型组显著降低。 结论　MMP-9可能参与臂丛根性撕脱后早期损伤反应，且葛根素可能有助于减轻该种损伤。     

臂丛损伤再生中GAP-43 mRNA及其蛋白的表达

目的：分析臂丛损伤后脊髓前角运动神经元表达GAP-43 mRNA及其蛋白的变化规律，探讨神经损伤再生的机制。方法：建立3种臂丛损伤模型：右C₇前根撕脱（A组）；右C₇前根撕脱＋同侧C5-T₁后根断离（B组）；右C₇前根撕脱+右C₅C₆间脊髓半横断（C组）。用荧光定量RT-PCR方法检测术后14 d时 C₇前角GAP-43 mRNA的表达量。用免疫组化方法检测术后1、 3、 7、14 d脊髓前角GAP-43免疫阳性运动神经元的表达。结果：对照组C₇前角GAP-43 mRNA呈低表达，损伤组GAP-43 mRNA表达显著上调。损伤组术后1 d、3 d时均未见C₇前角 GAP-43免疫阳性神经元，术后7 d各损伤组GAP-43免疫阳性神经元开始出现，14 d时免疫阳性神经元数目达到高峰。3组间比较，C组表达量最高，B组最低，A组居中。结论：臂丛损伤诱导运动神经元GAP-43 mRNA及其蛋白表达上调，GAP-43合成增加是神经元蛋白重组所致，与轴索再生和神经功能重建有关。     

脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶基因表达的变化

目的 :研究大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶 (nNOS)mRNA表达的变化规律。方法 :参考Nystrom方法建立大鼠脊髓压迫伤模型 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法测定伤段脊髓组织nNOSmRNA的表达情况。结果 :正常脊髓组织内存在nNOSmRNA的表达 ,脊髓压迫伤后nNOSmRNA表达迅速逐渐增强 ,在伤后 6h达到高峰。结论 :nNOS存在于正常的脊髓组织内 ,脊髓损伤后nNOSmRNA表达迅速增强 ,提示nNOS参与了继发性脊髓损伤过程 ,并可能是一种损伤因素。