蛋白激酶Cα在小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞中的表达变化

目的研究小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)定向诱导分化为神经样细胞过程中蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)的表达变化,探讨可能涉及ESC定向分化的信号机制.方法ES-D3细胞株用不含小鼠白血病抑制因子(mouseleukemiainhibitoryfactor,mLIF)的ESC培养液培养4 d,形成胚胎体(embryoid bodies,Ebs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10-7 mol/L维甲酸(retinoic acid,RA)诱导后,用神经特异性烯醇化酶(NSE)和NF-200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后第1、3、5、7和14天用Western印迹和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测PKCα亚型的表达变化.结果诱导前免疫组化发现PKCα在ES-D3细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞膜最明显;Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带,分子量约为84kD;诱导后第3天,NSE和NF-200开始表达,第7天达到高峰;诱导后Western印迹和RT-PCR方法都显示PKCα表达量急剧下降,以后逐渐升高,至第14天基本恢复至正常水平.结论在RA诱导ESC定向分化为神经样细胞过程中,PKCα有独特的时空表达特点,它可能对ESC的分化有非常重要的调控作用.     

GAP-43在新生大鼠视网膜及其诱导的骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的表达

目的 探讨生长相关蛋白43(growth associated protein,GAP-43)在新生大鼠视网膜发育过程中及在以新生大鼠视网膜细胞诱导体外培养的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)向视网膜神经节样细胞定向分化中的作用.方法 体外培养新生3 d大乳鼠视网膜细胞,应用免疫细胞化学方法检测GAP-43的表达;提取新生大鼠视网膜细胞总RNA,应用RT-PCR方法检测GAP-43 mRNA的表达.体外培养大鼠BMSC至第3代,经流式细胞仪检测干细胞表面标志物进行鉴定,应用乳鼠视网膜细胞诱导BMSC分化,观察诱导后细胞的形态学变化,并应用免疫细胞化学方法对诱导后第5天的细胞进行神经元及视网膜神经节细胞标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1鉴定,并应用RT-PCR的方法检测、分析GAP-43 mRNA的表达情况.结果 体外培养的新生大乳鼠视网膜细胞应用免疫细胞化学方法可检测到GAP43阳性表达;RT-PcR方法检测到新生大鼠的GAP-43 mRNA的表达;第3代BMSC经流式细胞仪检测CD71(+)、C LY29(+)、CD34(-)、CD45(-),经与大乳鼠视网膜细胞共培养的方法可诱导BMSC分化为视网膜神经节样细胞,免疫细胞化学染色表明其表达特异性标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1,分化后的神经节样细胞内可检测到GAP-43 mRNA阳性表达:结论本研究结果显示CAP-43不仅参与了大鼠视网膜发育过程,且GAP-43在以乳鼠视网膜细胞诱导BMsc定向分化为视网膜神经节样细胞这一过程中具有重要意义.     

蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

低氧诱导因子-1α在胚胎及出生后大鼠视网膜中的表达变化

目的 观察大鼠视网膜胚胎期及出生后早期发育过程中低氧诱导因子-1α(HIF -1α)的时空表达,探讨其表达变化与视网膜发育的关系。方法 实验大鼠分为孕12、16、20 d 组,出生后1、5、10 d组及成年组,每组各5只,共35只大鼠。用免疫组织化学方法、半定量逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）方法检测视网膜H IF-1α蛋白及HIF-1αmRNA的表达。结果 胚胎期大鼠视网膜神经上皮层及视网膜色素上皮层均有HIF 1α阳性表达,出生后发育早期视网膜神经上皮层及视网膜色素上皮层也可见HIF-1α阳性表达,以神经节细胞、内网层更明显。随着发育进展,其阳性表达主要位于视网膜节细胞层。大鼠视网膜HIF-1α蛋白及mRNA的表达在胚胎期最高、出生后发育期逐渐下降、成年期最低,其差异有统计学意义（P<0.01）。结论 大鼠视网膜胚胎及出生后发育过程中HIF-1α的表达存在时空上的变化,这种变化可能与大鼠视网膜胚胎期及出生后早期的发育密切相关。     

体外培养人胚胎来源视网膜干细胞的诱导分化

目的 探讨培养的人胚胎来源视网膜干细胞向视网膜终末细胞分化的可能性。方法 来自16～20周人胚胎的视网膜干细胞进行无血清体外培养,并分别进行有血清条件下体外诱导和用含视网膜色素上皮的眼杯模拟体内条件诱导的观察,采用免疫荧光法检测干细胞和视网膜终末细胞表面抗原的表达,采用实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果 从人胚胎视网膜神经感觉层分离出的视网膜干细胞,在体外诱导的条件下,可表达视网膜终末细胞标记PKCα、GFAP、Thy1,少数细胞表达nestin和MAP2;在模拟体内环境诱导后,则不仅表达上述细胞标记,而且rhodopsin和syntaxin表达阳性。实时荧光定量PcR法检测显示：诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论 RPE可以促进体外培养的视网膜干细胞向视杆细胞和无长突细胞分化。(中华眼科杂志,2004,40：448-452)     

牛磺酸体外诱导脐血干细胞分化为感光细胞生物学鉴定

目的 探讨牛磺酸诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)分化为感光细胞的实验条件,并鉴定其生物学特性.方法 从胎儿脐血中分离出MSCs进行原代培养,待细胞融合时,按1:2的比例进行传代.取第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44、CD45的表达.另取第3代脐血MSCs在最小必需培养基继续培养8～10 d,应用免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、视紫红质(RHOS)、蛋白激酶C(PKC)、巢蛋白(Nestin)的表达.结果 MSCs培养5～7 d后有间充质样细胞贴壁,3～4周后细胞生长达80%～90%融合,形态学类似骨髓源性MSCs.连续传5代,增生能力未见明显减弱.脐血MSCs的大部分细胞(>90%)处于G0/G.期,可表达MSCs的相关抗原CD29、CD44、CD90,但不表达CD34、CD45.经牛磺酸体外诱导后的脐血MSCs(71.4±11.1)%中等强度以上表达NSE,(21.0±7.8)%的细胞表达Nestin,(30.2±8.9)%表达RHOS,而不表达GFAP、PKC、MAP2.无牛磺酸诱导组的脐血MSCs仅(5.8±2.3)%表达NSE,其他抗原未见表达.结论 脐血的MSCs可在体外纯化增生,经牛磺酸体外诱导能使部分MSCs向感光细胞或表达RHOS的细胞分化.     

蛋白激酶C活性调节剂对豚鼠近视眼视网膜Mtiller细胞的作用及意义

目的研究蛋白激酶C（PKC）激活剂PMA和抑制剂GF109203X对豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞生长状态及PKC蛋白表达的影响。方法眼罩遮盖诱导近视模型,酶消化法培养其视网膜Mailer细胞,并鉴定。PMA、GF109203X分别干预近视眼Mailer细胞。MTT测细胞活力,TUNEL染色检测凋亡细胞,Westren blotting测PKC蛋白表达。结果95％以上的培养细胞阳性表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（Vimentin）。近视组PKC蛋白表达较正常组上调（P〈0．05）。PMA、GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞的抑制率升高和诱导其凋亡（P〈0．05）。PMA诱导近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达进一步上调,100nmol／L组和1000nmol／L组表达量高于10nmol／L组（P〈0．05）。1μmol／L和10μmol／L GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达下调,10μmol／L的抑制作用大于1μmol／L（P〈0．05）。结论PKC蛋白在豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞表达升高,且其表达受PMA和GF109203X调控。     

蛋白激酶C活性调节剂对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞的作用及意义

目的研究蛋白激酶C（PKC）激活剂PMA和抑制剂GF109203X对豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞生长状态及PKC蛋白表达的影响。方法眼罩遮盖诱导近视模型,酶消化法培养其视网膜Mailer细胞,并鉴定。PMA、GF109203X分别干预近视眼Mailer细胞。MTT测细胞活力,TUNEL染色检测凋亡细胞,Westren blotting测PKC蛋白表达。结果95％以上的培养细胞阳性表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（Vimentin）。近视组PKC蛋白表达较正常组上调（P〈0．05）。PMA、GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞的抑制率升高和诱导其凋亡（P〈0．05）。PMA诱导近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达进一步上调,100nmol／L组和1000nmol／L组表达量高于10nmol／L组（P〈0．05）。1μmol／L和10μmol／L GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达下调,10μmol／L的抑制作用大于1μmol／L（P〈0．05）。结论PKC蛋白在豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞表达升高,且其表达受PMA和GF109203X调控。     

无动物源性成分培养体系快速诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化

背景 随着视网膜色素上皮(RPE)细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)研究的开展,需要优化无动物源性成分(xeno-free)培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞(hESCs)向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法. 方法 将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养2d,第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF,第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021.倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量.结果 分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形.与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了(3.43±2.77)倍和(8.91±2.83)倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了(14.60±3.94)倍和(87.16±9.32)倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞.     

蛋白激酶Cα亚型在视网膜视杆-双极细胞发育过程中表达规律的体外实验研究

目的明确新生小牛视网膜视杆-双极细胞体外发育过程中蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的表达规律。方法分离培养新生小牛视网膜神经细胞,培养10、20、30和40 d的神经元用于免疫细胞化学染色,采用PKCα抗体标记视网膜视杆-双极细胞,用图像分析系统定量测量阳性细胞的免疫反应强度。结果培养10 d时,PKCα阳性神经元只有1~2个较短的神经突起;到培养20 d时,阳性细胞的一端为1个细长的神经突起,相对的另一端为丛状的短的树状突起,培养30 d及40 d的神经元保持培养20 d时神经元的形态特征。不同培养阶段的阳性细胞中PKCα免疫反应物质均位于细胞体和神经突起,定量分析显示培养20 d的阳性细胞免疫反应强度最高,培养30 d和40 d时阳性细胞PKCα免疫反应强度下降。结论培养20 d的视杆-双极细胞具备细胞形态和免疫反应特性上的成熟特征,PKCα的表达水平最高,为发育成熟的神经元。培养30 d以后,视杆-双极细胞逐渐衰老。实验结果为选择合适的供体材料进行视网膜移植提供了理论依据。     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

Down-regulation of Na-K-Cl cotransport by protein kinase C is mediated by protein phosphatase 1 in pigmented ciliary epithelial cells

The role of protein phosphatases in the regulation of Na-K-Cl cotransport was examined in human pigmented ciliary epithelial (PE) cells. Both a 37 kDa form and a 72 kDa form of protein phosphatase 1 (PP1) could be immunologically detected. The protein phosphatase inhibitor calyculin A stimulated Na-K-Cl cotransport by 89 +/- 12% at 10 n M, whereas okadaic acid had no effect at concentrations less than 100 n M. Calyculin A had no significant effect on either Na-K ATPase or ouabain-insensitive, bumetanide-insensitive 86Rb+uptake. These data suggest that PP1 plays a role in the inhibition of Na-K-Cl cotransport in PE cells. Treatment of cells with phorbol 12-myristate, 13-acetate (PMA), a protein kinase C (PKC) activator caused an 82% inhibition of Na-K-Cl cotransport. When cells were first treated for 5 min with PMA, 10 n M calyculin A stimulated Na-K-Cl cotransport by 53% compared to 101% by calyculin A alone. Treatment of cells with PMA after stimulation of Na-K-Cl cotransport by calyculin A resulted in a prompt 56% drop in cotransport activity. These data suggest that maximal inhibition of Na-K-Cl cotransport by PKC requires PP1 activity, but that a part of PKCs inhibitory effect is independent of PP1. The effect of PKC activation on PP1 was further examined by determining PP1 activity in cells pretreated with PMA. PP1 activity increased 38+/-8% in cells exposed to 1 microM PMA for 5 min. This stimulation was blocked by 100 n M staurosporine or 1 microM bisindolylmaleimide, two PKC inhibitors. An isomer which does not activate PKC (4 alpha phorbol didecanoate), did not stimulate PP1 activity. Thus PKC activation leads to an increase in PP1 activity in PE cells. Pretreatment of cells with the protein kinase A (PKA) inhibitor PHI 14-22 resulted in a partial reduction in calyculin A stimulation of cotransport, suggesting that PP1 and PKA function in a kinase-phosphatase regulatory loop. To determine whether other protein kinases might also be involved, several protein kinase inhibitors were tested, including KT5823 (protein kinase G, type II-specific), KN62 (calmodulin activated kinase-specific) and ML7 (myosin light chain kinase-specific). None prevented activation of Na-K-Cl cotransport by calyculin A, suggesting that these kinases are not involved in the activation of Na-K-Cl cotransport.     

光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导 MSCs 分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cells , MSCs）成为视网膜样细胞的可能性。 方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs ,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质（Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ,GFAP）等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。 结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。 RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin （0．3915±0．00644）、NSE （0．2019±0．00682）、GFAP （0.1972±0．00211）,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin（0．0983±0．00319）、NSE （0．1048±0．00323）、GFAP （0．1040±0.00254）,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin（0．0044±0．00126）、NSE（0．0498±0．00149）、GFAP（0．0467±0．00333）,组间差异有统计学意义。 结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

Vascular endothelial growth factor expression and secretion by retinal pigment epithelial cells in high glucose and hypoxia is protein kinase C-dependent

Retinal pigment epithelial (RPE) cells express vascular endothelial growth factor (VEGF) in response to high glucose or hypoxia. We hypothesised that VEGF expression and secretion by RPE cells in high glucose and hypoxia are regulated by protein kinase C (PKC). Primary cultured RPE cells from Sprague-Dawley rats were growth-arrested for 48 hr in 0.5% FBS in 5.6 or 30 mm D-glucose. Cells were exposed to hypoxic conditions (<1% O(2), 5% CO(2)) for the last 15-18 hr of growth-arrest. PKC -alpha, -beta(1), -delta, -epsilon, and -zeta were expressed by RPE cells and exposure to high glucose for 48 hr had no effect on expression as demonstrated by Western immunoblotting. High glucose, hypoxia or VEGF stimulated translocation of a number of the PKC isozymes to the membrane or particulate fractions implying activation. In response to high glucose or acute phorbol myristate acetate (PMA) stimulation, VEGF mRNA analysed by RT-PCR was increased. Intracellular VEGF protein identified by immunoblotting and confocal immunofluorescence imaging was significantly increased by high glucose, hypoxia or acute PMA stimulation. Calphostin C or a specific inhibitor of PKC-zeta prevented high glucose-stimulated VEGF expression in high glucose. VEGF secretion, as measured by ELISA in the culture medium, was enhanced in hypoxia but not in high glucose. Following exposure of RPE cells to PMA for 24 hr, PKC-delta was significantly down regulated, whereas PKC-alpha, -beta, -epsilon and -zeta remained unchanged. Secretion of VEGF in normal or high glucose, or hypoxia was significantly reduced following treatment with PMA for 24 hr but not with the PKC-zeta inhibitor. We conclude that in high glucose and hypoxia PKC isozymes are activated and are necessary for VEGF expression. Secretion of VEGF is enhanced in hypoxia and appears to be regulated by PKC-delta. RPE cells may contribute to the pathogenesis of retinopathy caused by high glucose and hypoxia through the expression and secretion of VEGF that are regulated by PKC isozymes.     

金丝桃素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞蛋白激酶C活性的影响

目的 研究金丝桃素(hypericin)对体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活性的影响。 方法 用含0.5～5.0 μmol/L金丝桃素的10％血清培养液培养人RPE细胞,在有或没有PKC激活剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸 （phorbol 12-myristate 13-acetate，PM A）预处理RPE细胞的情况下，用PKC检测试剂盒测定金丝桃素对细胞液PKC（cytosolic PKC，c-PKC）和细胞膜PKC（membranous PKC，m-PKC）活性变化的影响。 结果 未经PMA处理的人RPE细胞的c-PKC和m-PKC的原始活性分别为(35.34±4.1) pmol·min^-1·mg^-1和(62.52±8.8) pmol·min^-1 ·mg^-1。PMA处理细胞后，c-PKC在5 min内就迅速下降，20 min后下降缓慢，60 min降至处理前的18％，以后一直处于很低的水平。m-PKC在5 min后逐渐升高，至40 min达到高峰以后下降，60 min后恢复至对照水平，10 h后降至对照组的30％以下。用PMA处理RPE细胞48 h后，c-PKC和m-PKC都降低至不能测出。但若将金丝桃素与PMA同时加入后，能抵消大部分PMA对PKC的下降调节。 结论 金丝桃素能阻止RPE细胞的PKC转位，使PKC的活性发生变化，有可能促进RPE细胞的凋亡，防止增生性玻璃体视网膜病变的发生。 （中华眼底病杂志，2003，19：55-58）     

视网膜下液致视网膜色素上皮细胞增殖过程中蛋白激酶C活性的变化

目的 探讨视网膜下液（SRF）能否引起体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖及在其增殖过程中是否出现蛋白激酶C（PKC）的激活和转位,进一步明确RPE细胞增殖与RPE细胞中PKC信号系统变化的关系及PKC抑制剂的作用。方法 实验对象为体外培养的RPE细胞;刺激因素为提取的增生性玻璃体视网膜病变（PVR）为B、C级患者的SRF和来自角膜移植后的供体眼球所提供的正常玻璃体成分;PKC特异激活剂佛波酯（PMA）为阳性对照;DMEM培养液作为空白对照。用^3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR）掺入法测定各自的RPE细胞增殖情况。用B、C级SRF、正常玻璃体成分、PMA、DMEM培养液分别在不同的时间刺激RPE细胞,通过细胞裂解和离心获取细胞质和细胞膜蛋白粗提液,用同位素^32P标记和液体闪烁计数法检测细胞质和细胞膜PKC活性水平。选用PKC特异抑制剂N,N-二甲基鞘氨醇预处理各组细胞后,再分别观察各组RPE细胞中PKC活性表达水平及增殖情况。结果 用B、C级SRF和PMA处理过的RPE细胞出现高增殖;SRF和PMA都可以激活RPE细胞质中的PKC,并使其由胞质向胞膜转位,但SRF作用于RPE细胞时,胞膜上PKC活性峰值出现的时问较PMA明显延长。其中,B级SRF作用于RPE细胞时,胞膜上PKC活性峰值出现的时间较C级长且峰值低,增殖程度也低;正常玻璃体成分和DMEM培养液组未出现PKC活性变化和高增殖。用PKC特异抑制剂预处理各组细胞后,未出现PKC活性和细胞增殖的改变,组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 SRF可促进RPE细胞增殖,RPE细胞中的PKC是以激活和转位方式参与细胞增殖的过程;使用PKC特异抑制剂可阻止此过程发生。（中华眼科杂志,2006,42：738-743）     

Revisiting nestin expression in retinal progenitor cells in vitro and after transplantation in vivo

The purpose of this study is to characterize the co-expression of nestin--a neuroectodermal stem cell and a reactive glial marker-with various mature retinal cell markers in retinal progenitor cells (RPCs) expanded in vitro, followed either by in vitro induction or subretinal transplantation. Rat RPCs derived from embryonic day (E) 17 rat retina were expanded in serum free defined culture, and induced to differentiate by all-trans retinoic acid (RA). Following induction, cells were stained for nestin in combination with retinal neuronal and glial markers. Cultured cells were collected for quantitative RT-PCR gene expression analysis prior to and after induction. In a second series, passage 2 RPCs were transplanted into the subretinal space of S334ter-3 retinal degeneration rats at postnatal day 28. After 1-4 weeks, sections through the transplant were double immunostained for nestin and various retinal specific neuronal markers. The cultured RPCs treated with RA exhibited nestin co-expression with various retinal specific markers, including protein kinase C alpha (PKC), neurofilament 200 (NF200), cellular retinaldehyde binding protein (CRALBP), and rhodopsin. Following RA induction, quantitative RT-PCR analysis demonstrated downregulation of nestin, PAX-6, thy1.1, and PKCalpha, and upregulation of rhodopsin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and CrX. No nestin coexpression was observed with any of the retinal specific neuronal markers in RPC transplants in vivo except for some nestin-immunoreactivity overlapping with GFAP positive cells in the host retina. The role of nestin as a unique neural stem/progenitor cell marker should be reconsidered. Nestin expression during RPC maturation appears to be different in vitro versus in vivo.