小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞表面标记表达的比较

目的探讨小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)和骨髓源间充质干细胞(BMSCs)表面标记表达的差异。方法分别对小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞进行成骨、成脂、成心肌分化诱导、鉴定;流式细胞术与细胞免疫荧光法检测CD29、CD44、CD45和CD73的表达并进行比较。结果 BMSCs形态均一,呈长梭形;ADMSCs形态多样,呈梭形、星形、多角形等,胞体较大,表面分泌物较多;两者均可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和心肌样细胞。流式细胞术检测显示,BMSCs表面分子CD29、CD44和CD73表达率分别为(83.43±1.97)%、(90.33±0.81)%、(2.63±0.42)%;ADMSCs表面分子CD29和CD44的表达率分别为(53.1±1.05)%、(34.8±2.1)%,CD73表达不稳定,在1.8%~19.7%之间波动。两种细胞均不表达造血干细胞标记物CD45。免疫荧光显示,CD73分子与部分CD29、CD44阳性细胞共表达。结论小鼠BMSCs和ADMSCs均具有成脂、成骨、成心肌分化能力,但是在形态上和分子表达上均存在差异。BMSCs的CD44和CD29表达高于ADMSCs;而CD73的表达则相反,CD73在两种细胞的表达均较低,在ADMSCs的表达不稳定。     

低温保存脂肪间充质干细胞的生物学特性评价

目的 探讨低温保存对小鼠脂肪间充质干细胞（ADMSCs)体外培养的生物学特性和分化潜能的影响。方法 分离、培养小鼠ADMSCs,取第3代细胞置于液氮深低温（-196℃）冻存 12个月后复苏。MTT 法测定ADMSCs的增殖活性;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老;免疫细胞化学方法检测细胞表面分子CD73、CD90和CD105;条件培养基诱导后,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白（cTnT）,茜素红、碱性磷酸酶和油红 O 染色检测成骨、成脂诱导分化潜能,Real time-PCR检测cTnT、Gata4、Ost和Runx2。未经低温保存的第3代ADMSCs为对照。 结果 低温保存的ADMSCs其增殖活性、衰老率与未冻存细胞比较差异无显著性（P>0.05）。诱导后ADMSCs的cTnT阳性表达、茜素红、碱性磷酸酶和油红O染色呈阳性反应,冻存组与对照组比较差异无显著性(P>0.05）。结论 低温保存对ADMSCs体外生长特性和成心肌、成脂肪细胞、成骨细胞的分化潜能差异无显著性。     

兔心包液CD44和波形蛋白阳性细胞具有多项分化潜能

目的 探讨兔心包液内的细胞成分及其分化潜能,为心包液细胞基础研究和临床应用提供形态学依据。 方法 成年新西兰大白兔 30 只, 无菌开胸,用输液针软管抽取心包液,离心培养。取不同培养代次细胞,倒置显微镜下行细胞形态观察。利用免疫荧光技术对心包液细胞进行免疫显色,观察CD44、CD45、波形蛋白（vimentin）的表面标记。取第3代细胞进行成骨、成脂诱导。利用 PCR技术检测CD44、CD45、vimentin相关分子表达情况及分析表达量的差异。结果 成年兔心包液中含有形态较为均匀、生长状态良好、增殖能力强的细胞群。免疫荧光结果显示,CD44、vimentin阳性表达, 不表达CD45。成脂和成骨诱导后,可向成骨和成脂细胞分化。 结论 兔心包液中含有多项分化潜能的细胞,它们可能对心肌修复具有积极意义。     

不同来源间充质干细胞表面标记的比较

目的 探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）、人脂肪间充质干细胞（ADSCs）和人经血源子宫内膜间充质干细胞（MenSCs）之间表面标记的差异及随培养代次增加表面标记的变化。 方法 分别将HUCMSCs、 ADSCs和MenSCs培养至第3、6、9、12代,用流式细胞术、免疫荧光法检测CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45的表达并进行比较。 结果 培养MenSCs和HUCMSCs呈纺锤状,ADSCs形态多样以梭型、多角形为主。流式细胞术检测显示,人HUCMSCs、ADSCs和MenSCs的第3代CD29、CD44、CD73和CD105阳性表达率均在95%以上,CD45阴性表达;第3代MenSCs CD90的表达率为(72.43±0.76)%,均低于其在HUCMSCs（99.67±0.12）%和ADSCs（99.70±0.15）%表达（P＜0.001）。HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养代次的增加表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD45表达率差异无显著性（P>0.05）。免疫荧光结果与流式细胞术结果一致。 结论 HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养时间的增加稳定高表达 CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD45,MenSCs的CD90表达率低于其在HUCMSCs和ADSCs的表达。     

脂肪间充质干细胞CD73亚群心肌分化能力评价

目的探讨CD73+和CD73-脂肪间充质干细胞(ADMSCs)两个亚群向心肌分化能力的差异,筛选出心肌分化优势亚群,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考。方法流式细胞仪分选CD73+/CD73-ADMSCs亚群,HE染色观测其形态。体外5-氮杂胞甙(5-aza)诱导CD73+/CD73-亚群,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(c Tn T),Real-time PCR检测c Tn T、Gata-4变化;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记两个亚群后,移植到大鼠心肌内,免疫荧光法检测移植细胞c Tn T表达。结果 CD73+ADMSCs形态以小细胞为主呈细长形或纺锤状,CD73-细胞以宽大扁平或方形等为主。体外成心肌诱导后,CD73+ADMSCs心肌特异性c Tn T表达率为45.5%、CD73-亚群为5.75%,基因水平上CD73+亚群表达c Tn T、Gata-4明显高于阴性亚群(P0.01)。体内CD73+亚群较阴性亚群高表达c Tn T。结论 CD73+ADMSCs较CD73-ADMSCs具有更高向心肌分化的潜能,CD73+ADMSCs可能更具有心肌治疗的前景。     

心肌微环境与5-氮杂胞苷诱导脂肪间充质干细胞心肌分化的差异

目的 探讨体内心肌微环境及体外5-氮杂胞苷（5-aza）诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用差异。 方法 取小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞（ADMSCs）,对其进行表面标记和成骨、成脂分化能力鉴定。选取生长状态良好的第3代ADMSCs,分为5-aza体外诱导组、体内心肌移植组,体外诱导3周以及体内移植1周后,采用免疫荧光技术检测特异性心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。 结果 两种诱导方法ADMSCs均表达cTnT,5-aza诱导组3周表达率（33.33±3.79）%,移植组1周表达率（42.93±4.04）%,移植组1周较5-aza诱导组3周具有更高的分化效率（P<0.05）。 结论 体外5-aza化学诱导和体内心肌微环境均可使ADMSCs分化为心肌样细胞,但心肌微环境的诱导分化效率明显高于5-aza的作用。     

3种诱导法诱导CD73+脂肪间充质干细胞成心肌细胞效果的比较

目的 从脂肪来源的间充质干细胞（ADMSCs）的混合细胞群中分离纯化出CD73阳性的细胞亚群,证明几种不同诱导法诱导CD73细胞的
成心肌分化潜能。方法 体外分离培养1~3 月龄小鼠的ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73⁺和CD73^-两个细胞亚群。分别培养两组细
胞,利用5-氮杂胞苷（5-aza）、心肌组织裂解液和5-aza+心肌组织裂解液对两组分选出的细胞分别进行成心肌的诱导。利用免疫细胞化学技术
检测3种诱导法的成心肌效果。结果 未分选的ADMSCs可分化为成脂和成骨细胞,分选的CD73⁺细胞具备分化为心肌细胞的良好潜能。3种诱导法
均能诱导CD73⁺ADMSCs向心肌方向分化,5-aza诱导CD73⁺ADMSCs分化为心肌细胞率为（22.99±6.72）%,心肌组织裂解液组心肌细胞率（14.12±5.42）%,5-aza+心肌组织裂解液组心肌细胞率（26.94±6.11）%。3种方法比较,5-aza+心肌组织裂解液的诱导效果最佳（P<0.05）。结论 CD73+比CD73-
的ADMSCs更易于分化为心肌细胞。化学诱导因素和体外模拟心肌微环境,可高效诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。 目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。 方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。 结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。 方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子1 10 μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110 μg/L、转铁蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、维生素C 0.05 mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21 d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中“干”性蛋白表达的研究

检测原代分离培养的人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中CD29、CD34、CD44、CD133、HLA-DR、vWF、MRP1、ABCG2 、P75NTR及Nestin的表达.采用组织块贴壁培养法分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞,通过培养扩增后用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD133、HLA-DR及vWF的表达,应用免疫荧光技术检测人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中MRP1、ABCG2、P75 NTR、Nestin的表达.在培养的人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中,流式细胞仪检测示CD29、CD44表达阳性,CD34、CD133、HLA-DR及vWF表达阴性;免疫荧光示MRP1、ABCG2 、P75NTR及Nestin在人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中表达阳性且荧光定位在细胞的胞浆.人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞表达间充质干细胞的免疫表型;MRP1、ABCG2、P75NTR、Nestin在人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中表达阳性,提示人脐带与胎盘来源的间充质干细胞样细胞“干”性蛋白的表达情况相似.     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？ 目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。 结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

P> 不同年龄小鼠脂肪源间充质干细胞体外原代培养衰老和凋亡的变化/P>

目的 探讨小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)体外原代培养过程中衰老和凋亡变化。方法 用差速贴壁法对1月和24月龄小鼠（各30只）腹股沟脂肪组织的ADMSCs进行原代培养,免疫荧光技术检测第3代ADMSCs表面抗原CD73、CD90和CD105的表达,比较两组细胞的形态差异和生长情况,β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测ADMSCs衰老情况,PI-Hoechst33342双染色观察ADMSCs的凋亡变化。 结果 两组体外原代培养的ADMSCs均贴壁生长,具有典型干细胞的形态和生长特征,两组ADMSCs CD73、CD90和CD105的表型一致。SA-β-Gal染色显示：原代培养的老年组ADMSCs衰老比例比幼年组多,1月组原代培养2~7d的ADMSCs阳性率分别为（3.87±1.34）%、（4.21±1.22）%、（9.00±0.98）%、（11.20±1.24）%、（9.50±2.19）%和（13.20±2.93）%;24月组分别为（8.67±1.05）%、（10.23±0.98）%、（12.80±0.78）%、（17.10±1.13）%、（19.80±1.59）%和（24.70±1.86）%。PI-Hoechst 33342染液双染显示：1月组原代培养2~7d的ADMSCs凋亡率分别为(22.1±1.4)%、(36.7±1.62)%、(11.7±1.45)%、(38.4±1.57)%、(6.5±1.32)%和(11.3±1.63)%;24月组4~7d的ADMSCs凋亡率分别为(29.4±1.72)%、(37.6±1.64)%、(19.4±1.29)%和(18.9±1.25)%。 结论 老龄ADMSCs增殖能力下降,衰老、凋亡和坏死的细胞比例增加;随着ADMSCs原代培养时间的延长,其衰老增加,但凋亡和坏死无规律性变化。     

体外诱导胎盘间充质干细胞向表皮细胞的分化

背景：以往研究证明胎盘间充质干细胞经诱导可以向骨、软骨、肌肉、脂肪等间充质细胞分化。 目的：探讨体外诱导胎盘间充质干细胞分化为表皮细胞的可行性。 方法：分离培养胎盘间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面抗原,用含体积分数为2%胎牛血清以及20 μg/L表皮生长因子条件培养基诱导,诱导后细胞通过表皮细胞标志物CK19以及CK10染色鉴定。 结果与结论：胎盘间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,表皮细胞标志物CK19以及CK10免疫荧光染色阳性,提示胎盘间充质干细胞在体外具有分化为表皮细胞的能力,可以作为皮肤组织工程和干细胞研究的一种有效来源。     

Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol

BACKGROUND: The aim of this study was to isolate mesenchymal stem cells (MSCs) from amniotic fluid obtained by second-trimester amniocentesis. METHODS: A novel two-stage culture protocol for culturing MSCs was developed. Flow cytometry, RT-PCR and immunocytochemistry were used to analyse the phenotypic characteristics of the cultured MSCs. Von Kossa, Oil Red O and TuJ-1 stainings were used to assess the differentiation potentials of MSCs. RESULTS: Amniotic fluid-derived MSCs (AFMSCs) were successfully isolated, cultured and enriched without interfering with the routine process of fetal karyotyping. Flow cytometry analyses showed that they were positive for SH2, SH3, SH4, CD29, CD44 and HLA-ABC (MHC class I), low positive for CD90 and CD105, but negative for CD10, CD11b, CD14, CD34, CD117, HLA-DR, DP, DQ (MHC class II) and EMA. Importantly, a subpopulation of Oct-4-positive cells was detectable in our cultured AFMSCs. Under specific culture conditions, AFMSCs could be induced to differentiate into adipocytes, osteocytes and neuronal cells. CONCLUSIONS: We demonstrate that human multipotent MSCs are present in second-trimester amniotic fluid. Considering the great potential of cellular therapy using fetal stem cells and the feasibility of intrauterine fetal tissue engineering, amniotic fluid may provide an excellent alternative source for investigation of human MSCs.     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向肝细胞样细胞的分化

目的: 分离鉴定人胎骨髓中的间质干细胞(MSCs),探索其体外培养的生物学特性，并在化学因子作用下诱导其向肝细胞分化。方法: 利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓MSCs；利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志；添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化;采用DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导24 h,换用H-DMEM和 rh-HGF正式诱导人胎骨髓MSCs向肝细胞分化，并从形态学和特异性细胞化学染色等方面加以鉴定。结果: 从人胎骨髓中成功分离、纯化得到MSCs，P4代MSCs有92.3%的细胞处于G₀/G₁期；P5代MSCs有96.1%的细胞处于G₀/G₁期。流式细胞仪检测P3代MSCs结果显示：人胎骨髓MSCs表达CD29、CD44、CD105和CD106 ,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下，人胎骨髓MSCs可快速向脂肪及成骨细胞分化；在上述诱导条件下，人胎肝MSCs可分化为类肝细胞,表达特异性抗原甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）。结论: 人胎骨髓中含有丰富的MSCs,人胎骨髓来源的MSCs具有较强的多向分化潜能，经DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导及rh-HGF、nictinion等化学因子的作用，易向肝细胞样细胞分化，且免疫原性弱,是组织工程（生物型人工肝）的较为理想的种子细胞。     

Nanog蛋白在CD73+小鼠脂肪源间充质干细胞中的表达

目的 探讨Nanog蛋白在小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)中的表达规律.方法 体外分离培养ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73 -两个细胞亚群.体外分别培养两组细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光测定两组细胞Nanog蛋白的表达,并比较其差异.结果 CD73+ ADMSCs细胞约占总细胞的5％,形态上分为大细胞和小细胞.Nanog蛋白在CD73+ ADMSCs细胞中强阳性表达率(16.85±6.83)％,弱阳性表达率(81.78 ±7.19)％,阴性表达率(1.63±3.59)％;nanog蛋白在CD73 - ADMSCs细胞中强阳性表达率(5.74±2.79)％,弱阳性表达率(85.84 +37.31)％,阴性表达率(8.42±4.12)％.在Nanog阳性表达的细胞中可见不同分裂时相的有丝分裂细胞,CD73+细胞的分裂象明显多于CD73 -细胞.结论 CD73和Nanog可能均是ADMSCs特异性表达的标志,Nanog蛋白强阳性的细胞可能更具幼稚性.通常采用分离培养方法获得的ADMSCs是多种细胞的复合物.