流式细胞术对不同肿瘤细胞表面所表达血小板免疫相关抗原的检测

目的：研究不同肿瘤细胞表面血小板免疫相关抗原的表达。方法：利用流式细胞术观察了ＰＧＣＬ３、ＰＡａ、ＰＧ－３、ＰＣ－３Ｍ、ＭＧＣ８０３、ＥＳＣＬ、ＢｅＬ、ＴＣＴ、ＫＢ、Ａ２７８０、ＣＣＡ８０１共１１种人肿瘤细胞,其中包括二对高低不同转移能力的人肺癌（ＰＧＣＬ３和ＰＡａ）和人前列腺癌（ＰＧ－３和ＰＧ－３Ｍ）细胞阳性表达不同血小板免疫相关抗原的细胞数及其肿瘤细胞表面抗原表达的平均荧光强度。结果：１１种人肿瘤细胞膜表面均有ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ４２ａ和ＴＳＰ,等血小板免疫相关抗原不同程度的表达,在ＭＧＣ８０３细胞膜表面发现有ＣＬ８６较强的表达,ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６１和ＣＤ６２均未发现表达。１１种人肿瘤细胞系中ＣＤ９＋、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６３＋、ＴＳＰ＋细胞所占的比例各不相同,不同肿瘤细胞系每个抗原阳性细胞抗原表达的荧光强度也不同。与高转移ＰＧＣＩ３和ＰＧ－３Ｍ细胞相比,ＣＤ９在低转移细胞系ＰＡａ和ＰＧ－３上有较高的表达,ＣＤ４２ａ、ＴＳＰ有相对低的表达。ＣＤ４２ａ＋和ＴＳＰ＋细胞数和表达强度在高转移ＰＧＣＬ３和ＰＧ－３Ｍ细胞系均要高于低转移的ＰＡａ和ＰＧ－３;ＣＤ６３＋细胞数高转移ＰＧ－３Ｍ细胞系要比低转移     

用基因芯片研究人肺癌转移相关基因

目的 自制肿瘤转移相关基因芯片研究人肺癌高、低转移细胞系PG和PAa间以及肺癌、淋巴结转移癌与正常肺组织间的基因表达谱差异，筛选与肺癌转移相关的特异基因。方法 提取2种肺癌细胞系、人肺癌、淋巴结转移癌及周围正常肺组织的mRNA后逆转录标记cDNA探针，与自制的含399个肿瘤转移相关基因的微阵列膜杂交，QuantArray软件分析杂交信号强度获得差异表达基因。结果 正常肺组织与肺原发癌的基因表达谱有显著差异。淋巴结转移癌组织与PG高转移细胞系表达基因行聚类分析，共同表达且最具统计学意义的基因有64个，包括上调基因27个，下调基因37个。结论 多基因参与肺癌的转移过程，肺转移癌与高转移细胞系共同差异表达的基因可能与肺癌的高转移特性密切相关。     

乳腺癌中胎盘型谷胱甘肽S－转移酶基因的扩增与异常表达

在国内首次制备并用光敏生物素方法标记胎盘型谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－π）ｃＤＮＡ探针，应用斑点杂交技术检测２４例乳腺癌ＧＳＴ－π基因ＤＮＡ扩增与ｍＲＮＡ异常表达。结果发现，２４例乳腺癌中，３例（１２．５％）存在ＤＮＡ扩增，７例（２９．２％）存在ｍＲＮＡ异常表达，ＤＮＡ扩增和ｍＲＮＡ表达之间存在正相关性，二者均与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无明显相关，但ｍＲＮＡ异常表达与乳腺癌ＥＲ表达呈现负相关性。结果证实人乳腺癌中既存在ＧＳＴ－π基因ＤＮＡ扩增，又存在ｍＲＮＡ异常表达，提示ＧＳＴ－π与乳腺癌有密切关系。     

不同前体来源的人淋巴细胞经IL－2及抗肿瘤iRNA激活后抗肿瘤活性的体外研究

本文报道用ＩＬ－２及抗肿瘤ｉＲＮＡ作用于人胎儿肝、脾、胸腺及成人外周血淋巴细胞，用ＬＤＨ释放法测定其对Ｋ５６２及ＡＧＺＹ－８３ａ的杀伤作用，结果胎脾、肝效应细胞活性与成人外周血无显著差异，胸腺效应细胞的活性低于上述细胞。ＩＬ－２与ｉＲＮＡ联合诱导的效应细胞杀伤活性显著高于二者单独应用的活性。     

不同前体来源的人淋巴细胞经IL—2及抗肿瘤iRNA激活后…

本文报道用ＩＬ－２及抗肿瘤ｉＲＮＡ作用于人胎儿肝、脾、胸腺及成人外周血淋巴细胞，用ＬＤＨ释放法测定其对Ｋ５６２及ＡＧＺＹ－８３ａ的杀伤作用，结果胎脾、肝效应细胞活性与成人外周血无显著差异，胸腺效应细胞的活性低于上述细胞。ＩＬ－２与ｉＲＮＡ联合诱导的效应细胞杀伤活性显著高于二者单独应用的活性。     

不同转移潜能的人肿瘤细胞系金属蛋白酶活性分析

目的探讨不同转移潜能的人类肿瘤细胞的金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）活性与其侵袭转移潜能的相关性。方法分别选取具有不同转移潜能的人类肺癌细胞系（ＰＧ、ＰＡａ、ＢＥ１、ＣＬ３、ＬＨ７）、黑色素瘤细胞系（ＷＭ３５、ＷＭ１３４１ｂ、ＷＭ９８３ａ、ＷＭ４５１）及前列腺癌细胞系（ＰＣ，ＰＣ３Ｍ），经细胞培养，条件培养基的收集与浓缩，利用明胶Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法检测以上各组细胞ＭＭＰ２和ＭＭＰ９的产生及活性差异，并将这种差异与各自的转移潜能联系起来。结果转移能力相对较高的细胞系产生ＭＭＰｓ的能力相应强于转移能力相对较低者：ＰＧ高于ＰＡａ，ＢＥＩ高于ＣＬ３和ＬＨ７。在进展期黑色素瘤株ＷＭ９８３ａ和转移瘤株ＷＭ４５１出现了ＭＭＰ９的表达，早期瘤株则无。前列腺瘤细胞ＰＣ３的转移性克隆ＰＣ３Ｍ的条件培养基中有较高的ＭＭＰ９活性。结论肿瘤细胞的侵袭转移潜能与其产生ＭＭＰｓ的能力密切相关。     

血管内皮生长因子反义基因转染对高转移人巨细胞肺癌细胞系生 …

目的 探讨反义血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因转染在抑制恶性肿瘤生长和转移的抗肿瘤血管基因治疗中的意义。方法 利用基因重组技术构建正义和反义ＶＥＧＦ１２１ ｃＤＮＡ真核表达载体,用脂质体法转染高转移性人巨细胞肺癌细胞（ＰＧ）,经Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹免疫化学检测ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ和蛋白质的表达水平,并对转染前后细胞进行体外生长和裸鼠体内生长转移等多项生物学行为实验,结果 转染反义转     

转化生长因子α，β对人结肠腺癌细胞株HT_（29）细胞生长调节影响的研究

用生长曲线、３Ｈ－ＴｄＲ参入及细胞周期分析等方法，研究了ＴＧＦ－α，β在体外对人结肠腺癌细胞株ＨＴ（２９）细胞的生长调节作用，为进一步探讨ＴＧＦ－α，β对ＨＴ（２９）细胞的生长调节作用机制，采用Ｄｏｔ杂交分析探讨了ＴＧＦ－α，β对ＨＴ（２９）细胞ｃ－ｍｙｃ基因ｍＲＮＡ表达的影响。结果发现ＴＧＦ－α可促进ＨＴ（２９）细胞生长和增殖，而ＴＧＦ－β则抑制其生长和增殖，ＴＧＦ－α可增加其ｃ－ｍｙｃ基因表达，而ＴＧＦ－β则抑制其ｃ－ｍｙｃ基因表达。本研究还采用肿瘤细胞无血清培养技术以及分子生物学方法，观察了ＨＴ（２９）细胞自分泌生长以及在其自分泌生长调控中ＴＧＦ－α，β，βｍＲＮＡ表达。研究发现ＨＴ（２９）细胞具有自分泌调控生长能力，在无血清培养条件下ＴＧＦ－αｍＲＮＡ表达增加，而ＴＧＦ－βｍＲＮＡ表达则受到某种程度的抑制。上述研究结果表明ＴＧＦ－α，β分别作为正、负生长调节因子在ＨＴ（２９）细胞自分泌生长调节中可能具有重要作用。ＴＧＦ－α，β平衡失调同结、直肠癌发生、发展具有密切关系。     

乳腺癌中胎盘型谷胱甘肽S—转移酶基因的扩增与异常表达

在国内首次制备并用光敏生物素方法标记胎盘型谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－π）ｃＤＮＡ探针，应用斑点杂交技术检测２４例乳腺癌ＧＳＴ－π基因ＤＮＡ扩增与ｍＲＮＡ异常表达。结果发现，２４例乳腺癌中，３例（１２．５％０存在ＤＮＡ扩增，７例（２９．２％）ｍＲＮＡ异常表达，ＤＮＡ扩增和ｍＲＮＡ表达之间存在正相关性，二者均与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无明显相关，但ｍＲＮＡ异常表达与乳腺癌ＥＲ表达呈现负相关性，     

CD44V6在不同转移能力人大肠癌细胞系中的表达

目的：探讨大肠癌细胞ＣＤ４４Ｖ６的表达与其转移潜能之间的关系。方法：应用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析技术，从蛋白水平到分子水平、从定性到定量，分析不同转移能力大小肠癌细胞ＣＤ４４Ｖ６的表达。结果：人大肠癌ＨＴ２９、ＬｏＶｏ细胞系均有ＣＤ４４Ｖ６变异体ｍＲＮＡ和蛋白表达。在ｍＲＮＡ和蛋白水平，高转移能力的ＬｏＶｏ细胞表达强度均高于低转移能力的ＨＴ２９细胞。实验还发现：ＬｏＶｏ细胞系内不同     

BRI基因在一对转移能力不同的肺腺癌细胞系中的序列分析与表达研究

目的 确认淀粉样纤维蛋白基因(amyloid fibrils，BRI)基因在l对同源但转移能力不同的肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973中的序列并分析其表达。方法 采用测序技术，Northern印迹杂交。G显带后荧光原位杂交分析BRI基因在肺腺癌细胞系的序列与表达。结果 BRI基因在高转移肺腺癌细胞系Anip973中高表达，在其低转移母系AGZY83-a中低表达，两细胞系BRI基因染色体定位区均存在断裂重排。该基因染色体定位区在Anip973中出现扩增。已知BRI基因的-116bp～-5bp处碱基序列和-115bp～-5bp处碱基序列在AGZY83-a和Anip973中分别突变为CTCAGCAGCCCGC和TCAGCCGC。结论 BRI基因在转移能力不同的肺腺癌细胞系差异表达与该基因的染色体定位区域的断裂重排无关，与该基因染色体定位区拷贝数增加及5′非翻译区存在不同的突变可能相关。     

Differential expression of RAB5A in human lung adenocarcinoma cells with different metastasis potential

For the sake of better understanding the molecular mechanism of neoplasia, we have used the mRNA differential display technique to analyze two human lung adenocarcinoma cell lines, AGZY83-a and Anip973. Anip973 was isolated from AGZY83-a, but manifested much higher metastatic potential than the parent line. We found that a significant differential cDNA fragment in Anip973 was over-expressed, then over-expressed cDNA fragment was cloned and sequenced. It showed that the over-expressed cDNA in Anip973 was RAB5A cDNA. And the RAB5A cDNA sequence was corresponding between the two cells. To determine whether RAB5A may be differentially expressed in the two human lung adenocarcinoma cells at protein level, we further detected RAB5A protein in the two cells by using immunofluorescent method. RAB5A protein was upregulated in highly metastatic Anip973. We also detected the difference in RAB5A gene expression at RNA level in human non-small cell lung carcinoma by RT-PCR. Using immunohistochemical staining, we also examined RAB5A change at protein level in 45 cases human non-small cell lung carcinoma paraffin sections. The results proved the evidence of upregulation of RAB5A in malignant tumor, indicated over-expression of RAB5A gene was correlated with the malignant degree and metastatic potential of lung cancer(² test, p <0.01). The RAB5A gene is a member of RAS superfamily, which can transcribe GTP-binding protein that plays an important role in signal transduction of protein trafficking at the cell surface and GDP/GTP cycle in the regulation of endocytotic membrane traffic. Thus our results indicated that over-expression of the RAB5A gene was involved in the process of transformation from AGZY83-a to the higher metastatic cell line Anip973. The result may be a powerful experimental evidence that over-expression of RAB5A gene associated with neoplasia metastasis.     

高低转移肺腺癌细胞系中肿瘤抑制基因p16、p21和p53表达研究

目的 探讨肿瘤抑制基因对肺腺癌细胞生长的抑制作用。方法 利用FuGene转染方式分别将p21和p16基因的表达质粒转入－对肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83－a中,同时用含野生型p53 基因的腺病毒感染p16基因转染前后的这一对细胞系。对P16和P21蛋白过表达的细胞系进行了细胞生长曲线、克隆形成率、原位末端标记分析和流式细胞仪分析。结果 p16基因的过表达只能使细胞系的G1期细胞比例提高,但细胞生长曲线,克隆形成率均未出现改变,未检测到凋亡信号。P21蛋白过表达的一对细胞系细胞生长曲线斜率降低,克隆形成能力下降,并出现明显的G1期阻滞,但未检测到凋亡信号。p53基因感染AGZY83－a,Anip973及经过p16基因转染的细胞AGZY83－ap16和Anip973p16后呈现时间依赖性表达,细胞生长曲线和四唑盐比色法分析提高,野生型p53基因的大量表达明显抑制以上4种细胞的生长,Anip973和Anip973p16的生长抑制率高于AGZY83－a和AGZY83－ap16;Anip973p16和AGZY83-ap16的生长抑制率高于Anip973和AAGZY83－a。这4种细胞在感染p53后出现典型的凋亡信号。结论p16基因的过表达并不能抑制细胞系的生长,而p21基因的过表达通过G1期阻滞抑制这1对肺腺癌细胞的生长;野生型p53基因在AGZY83－a和Anip973中高效表达可产生明显的细胞生长抑制效应;野生型p53基因对肺腺癌高转移细胞系Anip973抑制作用更为明显。     

COX‐2‐Mediated Regulation of VEGF‐C in Association With Lymphangiogenesis and Lymph Node Metastasis in Lung Cancer

The mechanisms underlying the effects of COX‐2 on tumor lymphangiogenesis remain largely undefined. Here, the human lung cancer cell lines A549, 95D, Anip973, and AGZY83‐a with different metastatic capacities were investigated by immunostaining, western blotting, and real‐time RT‐PCR. We observed increased expressions of COX‐2 and VEGF‐C in the three highly metastatic cell lines compared with the less metastatic AGZY83‐a cell line. The COX‐2‐specific inhibitor Celecoxib suppressed VEGF‐C expression whereas the main COX‐2 metabolite PGE₂ elevated VEGF‐C expression in Anip973 and AGZY83‐a cells in positive and negative experiments. To determine the functional link to COX‐2 more specifically and elucidate the mechanistic pathway, we used a siRNA to knock down the high COX‐2 expression in Anip973 cells and transfected a COX‐2 cDNA to enhance the low COX‐2 expression in AGZY83‐a cells, and then treated the cells with EP1/EP4 agonists or antagonists, respectively. The results revealed that the EP1/EP4 agonists significantly increased VEGF‐C production in the COX‐2‐knockdown Anip973 cells. In contrast, the EP1/EP4 antagonists diminished VEGF‐C production in the COX‐2‐overexpressing AGZY83‐a cells. Furthermore, animal models provided evidence that Celecoxib decreased VEGF‐C expression, lymphangiogenesis, and lymph node metastases in Anip973 cells, whereas PGE₂ treatment increased the same factors in the parental AGZY83‐a cells. A positive correlation between COX‐2 and VEGF‐C was also confirmed in vivo. The present data suggest that COX‐2 regulates VEGF‐C expression via the PGE₂ pathway, and that EP1/EP4 receptors are involved in PGE₂‐mediated VEGF‐C production. Thus, COX‐2 may represent a candidate gene for blocking tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis. Anat Rec, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

Inhibition of Cyclooxygenase‐2 Suppresses Lymph Node Metastasis via VEGF‐C

Most experimental work addressing cyclooxygenase‐2 (COX‐2) inhibitor has focused on suppressing hematogenic spread. Little is known about the mechanism by which this inhibitor can also block lymphatic metastasis. Here, the effects of COX‐2 inhibitor on vascular endothelial growth factor‐C (VEGF‐C) expression, lymphangiogenesis and lymph node metastasis were investigated. Utilizing the highly metastatic human lung adenocarcinoma cell line Anip973 and its parental line AGZY83‐a, which has a low metastatic capacity, we found elevated VEGF‐C and COX‐2 immunoreactivity in Anip973 cells compared with AGZY83‐a cells. Celecoxib down‐regulated expression of VEGF‐C mRNA and protein in Anip973 cells while PGE₂ up‐regulated expression of VEGF‐C mRNA and protein in AGZY83‐a cells in a concentration‐dependent manner. The expression of COX‐2 and VEGF‐C was significantly increased in xenografted Anip973 tumors compared with AGZY83‐a tumors. The Anip973 tumors showed more lymphatic vessels and lymph node metastasis than the AGZY83‐a tumors. In vivo, celecoxib decreased VEGF‐C expression in Anip973 tumor‐treated mice to a similar level to that in the AGZY83‐a tumor‐treated mice. Consistent with this decrease in VEGF‐C expression, the density of lymphatic vessels and lymph node metastasis in Anip973 tumor‐treated mice were suppressed to approximately that found in the AGZY83‐a tumor‐treated ones. Taken together, our results suggest that the differential expression of COX‐2 and VEGF‐C might help explain the different metastasis phenotype of lung adenocarcinoma cancer, and that COX‐2 inhibitor mediates VEGF‐C to block lymphangiogenesis and lymph node metastasis. Thus, COX‐2 may be a potential therapeutic target for blocking lymph node metastasis in lung adenocarcinoma. Anat Rec, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

抗人肺癌细胞转移相关抗原单克隆抗体的制备及初步鉴定

用转移能力及其它生物学特性不同的2个人肺腺癌细胞系免疫BALB/c小鼠,制备出一组可与人肺腺癌细胞发生特异性反应,而与其它脏器肿瘤组织无交叉反应的单克隆抗体。经初步鉴定,其中的3个单抗分别识别低转移或高转移肺腺癌细胞系表面抗原。     

肺腺癌细胞微环境及转移与黏附分子表达的关系

目的研究肺腺癌细胞生长环境及转移性与黏附分子CD44v6和CD29的表达关系。方法将起源相同、转移性不同的两个肺腺癌细胞系AGZY和Anip分别用简便肿瘤多细胞球体(MTS)培养法培养，并设常规单层贴壁细胞培养对照。通过倒置显微镜、扫描及透射电镜观察MTS形成情况，并用免疫组化法分别对MTS及贴壁细胞上CD44v6和CD29表达进行检测。结果MTS培养成功，贴壁细胞与MTS在细胞结构及细胞连接结构上相似，两种MTS在形态及结构上差异无显著性。免疫组化结果显示，CD29在高转移性的Anip细胞及其MTS上呈阳性表达；在低转移性的AGZY细胞及其MTS上阴性表达。CD44v6在Anip和AGZY细胞及MTS上均呈阳性表达，差异无显著性。贴壁细胞与MTS上两种黏附分子表达均无差异。结论成功建立了一种简易制备MTS的方法。细胞生长方式(单层贴壁与MTS)可能不影响CD44v6和CD29的表达。CD29表达可能与肺腺痛转移性相关；CD44v6表达可能与肺腺癌转移无关。     

BRI基因的表达与非小细胞肺癌发生及转移潜能的关系

目的 探讨BRI基因在人非小细胞肺癌中的差异表达情况及其与肺癌发生及转移能力形成的相关性。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹杂交方法分析BRI基因在一对遗传背景相同、转移能力不同的人肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip-073中的差异表达,并进一步检测BRI基因在另外6个非小细胞肺癌细胞系(SPC-A-1,A549,95D,TKB-18,GLC-82,PAa)及30例临床肺癌标本中的表达情况。结果 BRI基因在2细胞系中存在明显的差异表达,在具有高转移潜能的Anip973中高表达。在其他6个细胞系中BRI的表达与肺癌转移潜能可能有关。同时发现与同一病例的正常肺组织相比,BRI基因在肺癌组织中高表达,其过表达在有淋巴结转移的肺癌为6／8,无转移者为45．5％(10／22),并且BRI基因在肺癌与正常肺组织之间存在转录本的差异。结论 BRI基因在肺癌中表达上调,其1．6kb转录本表达的增加可能与肺癌的发生和转移能力的形成有关。     

野生型p53基因诱导凋亡相关基因ANNEXIN A2的表达研究

目的探讨胡基因过表达介导不同转移潜能肿瘤细胞的凋亡分子机理，寻找与细胞凋亡和肿瘤转移的相关基因。方法应用mRNA差异显示方法分析腺病毒介导的野生型,053基因感染不同转移潜能的肺癌细胞系前后存在的表达差异基因，并用逆转录一聚合酶链反应、Northern印迹和Western印迹方法加以验证。结果分析发现，在柳基因诱导后ANNEXIN A2基因的表达显著差异有统计学意义，经加基因诱导后ANNEXIN A2基因的表达有明显下调。并且以Arfip 973细胞的表达缺失最为显著。经逆转录一聚合酶链反应、Northern印迹和Western印迹方法也验证了这种差异的存在。结论表明ANNEXIN A2基因的表达与p53基因诱导的肿瘤细胞凋亡存在密切的相关性。