榄香烯诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：榄香烯是从姜科植物莪术中提取的抗肿瘤药物,我们应用榄香烯治疗神经胶质瘤取得了较为显著的疗效,本研究探讨榄香烯的抗胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡作用。方法：^3H-TdR掺入法检测榄香烯对鼠源性C6胶质瘤细胞及人源性SHG-44胶质瘤细胞的体外增殖抑制效应,Hoechst33258／PI荧光染色法观察细胞形态学改变,流式细胞仪和DNA凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：榄香烯能有效抑制C6／SHG-44胶质瘤细胞的恶性增殖,^3H-TdR掺入法检测榄香烯处理不同时间(1～4天)的IC50,C6细胞为7．33--11．02mg／L,SHC-44细胞为13．29～27．16mg／L。在相同药物浓度下,C6细胞较SHG-44细胞敏感。经榄香烯作用后,C6／SHG-44胶质瘤细胞核固缩、边集,核浆比例减小并见有凋亡小体形成,DNA直方图观察到特征性亚倍体峰(Ap峰),DNA凝胶电泳出现有明显的梯状条带。结论：榄香烯有显著的抗胶质瘤细胞增殖作用,并能诱导胶质瘤细胞凋亡。     

外源性IFN-β基因对裸鼠SHG44胶质瘤的诱导凋亡研究

目的:探讨β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及人β干扰素裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性和作用机制.方法:建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色以及电镜,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用.结果:IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论:IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长并诱导胶质瘤细胞凋亡,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.     

miRNA-34a对胶质瘤SHG-44细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)在人脑胶质瘤组织中的表达以及其对胶质瘤SHG-44细胞增殖和凋亡的影响。方法:20例胶质瘤组织标本均取自于青岛医学院附属医院神经外科(2007年01月至2010年12月),作为对照的正常脑组织取自5位重症脑外伤需行减压手术的患者。Real-time PCR检测胶质瘤组织中miR-34a的表达。体外转染miR-34a mimics至SHG-44细胞中,MTT实验、流式细胞术检测SHG-44细胞的增殖、细胞周期及凋亡。结果:miR-34a在人脑胶质瘤组织中的表达量明显低于正常脑组织,其在Ⅲ、Ⅳ期胶质瘤组织中表达量明显低于Ⅰ、Ⅱ期胶质瘤组织。miR-34amimics体外转染组与空白组相比,其细胞增殖抑制率明显提高[(37.24±5.72)%vs(4.19±0.63)%,P<0.01];miR-34amimics转染组SHG-44细胞G1期比例明显高于空白对照组[(61.78±2.01)%vs(50.91±1.19)%,P<0.05];且miR-34a转染组细胞凋亡率与空白组细胞相比显著升高[(15.28±3.65)%,vs(2.07±0.84)%,P<0.01]。结论:miR-34a在人脑胶质瘤组织中低表达,miR-34a可抑制SHG-44细胞的增殖、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。     

IFN-β基因诱导裸鼠胶质瘤Fas 表达上调及细胞凋亡的实验研究

 目的 研究β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及能否诱导胶质瘤细胞Fas表达上调,并探讨了β干扰素基因诱导细胞凋亡及Fas表达上调之间的联系. 方法 建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用以及胶质瘤细胞Fas表达情况. 结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡,胶质瘤细胞Fas表达明显高于对照组. 结论 IFN-β基因能够抑制人脑胶质瘤生长,并诱导胶质瘤细胞凋亡;IFN-β基因诱导胶质瘤细胞凋亡可能是Fas表达上调的结果.     

人脑胶质瘤细胞SHG-44照射后COX-2表达与放射敏感性的关系

目的:探讨人脑胶质瘤细胞SHG-44照射存活后代细胞对放射敏感性的变化,以及环氧合酶-2(COX-2)的表达情况,为临床使用COX-2抑制剂提供理论依据。方法:采用克隆形成率研究SHG-44及SHG-44照射存活后代细胞的放射敏感性;并分别用RT-PCR方法及免疫组化的方法检测COX-2基因mRNA和蛋白的表达情况。结果:与SHG-44细胞相比,SHG-44照射后代细胞对放射的敏感性下降,COX-2 mRNA及蛋白表达均升高。COX-2表达水平与SHG-44照射后代细胞放射敏感性呈负相关。结论:辐射诱导了SHG-44细胞COX-2表达的升高,使SHG-44照射后代细胞对放射敏感性下降,COX-2表达的升高可能是导致其辐射耐受的原因之一。     

IFN-β基因诱导裸鼠胶质瘤Fas表达上调及细胞调亡的实验研究

目的研究β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及能否诱导胶质瘤细胞Fas表达上调,并探讨了β干扰素基因诱导细胞凋亡及Fas表达上调之间的联系.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用以及胶质瘤细胞Fas表达情况.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡,胶质瘤细胞Fas表达明显高于对照组.结论 IFN-β基因能够抑制人脑胶质瘤生长,并诱导胶质瘤细胞凋亡;IFN-β基因诱导胶质瘤细胞凋亡可能是Fas表达上调的结果.     

去甲二氢愈创木酸诱导体外恶性胶质瘤细胞凋亡的研究

目的：观察去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid,NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞凋亡的影响,并探讨其发生的可能机理。方法：采用MTT（methy thiazolyl tetrazolium)法检测细胞增殖抑制的情况。利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测体外培养细胞的凋亡情况,用免疫组织化学,原位杂交和图像分析等方法检测bcl-2基因mRNA和蛋白的表达水平。结果：（1）一定浓度（100μmol/L）的NDGA处理SHG-44细胞不同时间后,在NDGA抑制细胞增殖的同时,也可诱导此细胞发生凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞数增加越明显;（2）免疫组化染色结果表明,一定浓度的NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG-44细胞bcl-2蛋白表达水平降低,且随着作用时间的延长,这种趋势更加明显,与细胞凋亡的发生呈负相关;（3）原位杂交结果显示;NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG-44细胞bcl-2基因mRNA的表达水平降低,结果与免疫组化检测一致。结论：NDGA可诱导SHG-44细胞的凋亡,这种作用可能与其下调bcl-2基因的表达有关,确切机制有待进一步深入研究。     

BRM释介素抗肿瘤作用及作用机理研究

目的：研究中药复方胶囊BRM释介素的抗癌活性及诱导人神经胶质瘤细胞SHG-44、人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡作用。方法：运用MTT法检测BRM对体外人癌细胞株的抑制作用；运用小鼠移植瘤模型观察BRM体内瘤活性，应用电镜、AnnexinV-FITC／PT双染流式细胞胞仪分析、琼脂糖凝胶电泳观察BRM诱导SHG-44，MCF-7细胞发生凋亡的作用。结果：BRM释介素体外对SHG-44，MCF-7细胞具有明显的抑制作用。体内对小鼠移植性肿瘤：胰腺癌(MPC-83)、艾氏腹水癌(EAC)、肉瘤(S-180)、神经胶质瘤(G422)表现出较显著的抗癌活性，SHG-44和MCF-7在BRM水提液作用下发生细胞凋亡，表现为细胞固缩、核染色质靠边，出现马蹄形，半月形。Annexin V-FITC／PT流式细胞仪分析，BRM作用24—38h，早期和中晚期凋亡细胞明显增多。BRM水提液(2．5mg生药)作用24～48h，细胞DNA裂解片断呈典型的梯带。结论：BRM释介素的抗肿瘤活性与诱导细胞凋亡有关。     

Galectin-3调控Wnt信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的:半乳糖凝集素-3（Galectin-3）调控Wnt信号通路对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR及Western blot检测人脑胶质瘤组织中Galectin-3的mRNA和蛋白表达;Western blot检测人脑胶质瘤U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3的蛋白表达;将Galectin-3的特异性siRNA(Galectin-siRNA)转染人脑胶质瘤U87细胞,Western blot、流式细胞术分别检测转染48 h后Galectin-3、Wnt5a、β-catenin和Cleaved caspase3蛋白表达及细胞凋亡率。结果:Galectin-3在人脑胶质瘤组织mRNA和蛋白表达均显著高于瘤旁组织（P＜0.01）;U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3蛋白表达从高到低为U87>U251>SHG-44,选择U87细胞作为后续研究;Galectin-3-siRNA1的Galectin-3蛋白表达最低,选择作为后续研究;NC-siRNA组细胞凋亡率、Cleaved caspase3、Wnt5a、β-catenin蛋白表达与对照组差异不显著（P＞0.05）,与对照组比较,Galectin-3-siRNA组细胞凋亡率明显升高,Cleaved caspase3蛋白表达明显升高,Wnt5a和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结论:沉默Galectin-3表达可诱导人脑胶质瘤细胞凋亡,机制可能与Wnt信号通路的下调有关。     

白藜芦醇抑制人脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡比较

 目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res）体外抑制U251、U87和SHG-44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证Re8确可导致U251细胞凋亡。方法 MTT比色法测量不同剂量的Res作用U251、U87和SHG-44胶质瘤细胞24h后对增殖的影响及不同剂量的Res作用U251、U87和SHG-44细胞6h、24h、48h后的影响。流式细胞仪用Annexin V-FITC和PI双染检测U251、U87和SHG-44细胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342荧光染色、透射电镜（TEM）观察U251细胞形态改变，流式细胞仪测定U251细胞的细胞周期改变。结果 Res明显抑制U251、U87和SHG-44细胞的生长和增殖（P〈0．01）且对U87细胞的抑制作用最强，U251和SHG-44细胞次之；对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Re8所致的U251、U87和SHG-44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对U87细胞的凋亡作用强于U251和SHG-44细胞。U251凋亡细胞的细胞周期主要发生G，期阻滞。结论 Res对U251、U87和SHG-44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞更明显，对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。     

ANTITUMOR EFFECT OF BRM

Apoptosis or programmed cell death plays an important role in antitumor drug action. Malfunctions of apoptosis have been implicated in many forms of human disease. It is well known that antitumor agents induce apoptosis through various manner in tumor cells[1]. BRM is a traditional medicinal compound herb in china. In recent years BRM was shown to exhibit antitumor activity in clinical practice. In this article, we proved that BRM and its water extracts could induce apoptosis in Suzhou hu…     

蛋白激酶Cα在人神经胶质瘤耐药细胞株凋亡中的作用

背景与目的：蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）参与肿瘤的发生、发展及预后。本研究探讨蛋白激酶Cα（Protein kinase Cα,PKCα）在人神经胶质瘤耐药细胞株SHG-44／ADM发生细胞凋亡中的作用和机制。方法：应用阿霉素浓度递增和间歇诱导法建立SHG-44／ADM耐药株．采用PKCα激活剂PMA和抑制剂Staurosporine分别干预SHG-44/WT和SHG44／ADM细胞株．激酶分析PKCα活性,荧光分光光度计检测细胞内阿霉素浓度．流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：PKCα激活剂PMA增强细胞PKCα和MDR-1的活性．同时降低细胞凋亡率：PKCα抑制剂Staurosporine抑制细胞PKCα和MDR-1的活性．增加细胞凋亡率。结论：PKCα通过MDR-1参与神经胶质瘤耐药细胞的凋亡．     

对乙酰氨基酚联合外照射对脑胶质瘤细胞照射后代增殖的影响

Objective: To study the effects of acetaminophen (ACE) combined with radiation on the progeny of the human glioma cell line SHG-44, and to investigate if ACE may be an useful therapeutic radiosensitivity agent in the treatment of recurrent human glioma. Methods: A randomized, controlled experiment, was performed at the Department of Radiology Laboratory, the First Hospital Affiliated to Soochow University, between September 2004 and January 2006. Brain glioma SHG-44 cells were divided into three groups: SHG-44, SHG-44-10, and SHG-44-10 + ACE cells groups. The SHG-44-10 cells group was irradiated with dose of 10 Gy by a linear accelerator (6 MVX). It was passaged for 15 generations and cultured in RPMI-1640 culture media. Then SHG-44-10 + ACE cells group was treated with ACE. Measures: Community re-double time, mean lethal dose (DO), extrapolation number (N), fraction surviving fraction irradiated by 2 Gy dose (SF2), quasi-threshold dose (Dq), and cell cycle. Results: The SF2 of the SHG-44, SHG-44-10, and SHG44-10 + ACE cells groups were 70.8%, 80.6% and 45.2%, respectively, with significance (P = 0.040). The SHG-44-10 and SHG-44-10 + ACE cells groups were irradiated with 8 Gy. After 12 hours, the G2/M ratio of the SHG-44-10 and SHG-44-10 + ACE cells groups were indicating significantly higher ratio compared to pre-irradiated groups (P<0.01). After 24 hours, the G2/M ratio of the SHG-44-10 cells group decreased rapidly, while the ratio of the SHG-44-10 + ACE cells group still maintained in high level. Conclusion: In the present study, Subtoxic dose of ACE increased the radiosensitivity of the progeny of irradiated human glioma cell. ACE may be an useful radiosensitivity agent in the treatment of recrudescent human malignant glioma.     

PTEN基因诱导人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡及bcl-2蛋白表达下调

目的　探讨PTEN基因对人脑胶质瘤SHG 44细胞凋亡及凋亡相关基因bcl 2表达的影响 ,阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机理。方法　PTEN基因体外转染SHG 44细胞 ,筛选阳性细胞克隆 ,以原位杂交、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞的凋亡情况以免疫荧光法检测bcl 2基因的表达。结果　PTEN基因转染的SHG 44细胞有PTEN基因和蛋白的表达。透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞浆浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现 ;流式细胞仪示细胞周期从G1 期到S期发生抑制 ,并且在G1 期峰前出现一明显的凋亡峰 (1 2 .9% ) ;细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带 ;bcl 2的表达也显著下调。转染空载体和未转染的SHG 44细胞无明显的凋亡表现。结论　PTEN基因可诱导SHG 44细胞凋亡 ,并下调bcl 2蛋白的表达 ,这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制之一     

Rab31对神经胶质瘤细胞增殖迁移侵袭的影响及机制研究

目的:研究Rab31对人神经胶质瘤细胞增殖迁移侵袭的影响及相关分子机制。方法:Western blot检测正常人胶质细胞NHA和3株人神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229中Rab31表达;将3种Rab31沉默siRNA及其对照分别转染至神经胶质瘤SHG-44细胞中,分别记为si-Rab31-1组、si-Rab31-2组、si-Rab31-3组和si-NC组,Western blot验证转染效率,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移侵袭,Western blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K p101、p-AKT和AKT表达水平。结果:与正常人胶质细胞NHA相比,神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229中Rab31蛋白表达显著增加（P＜0.01）;与si-NC组比较,si-Rab31-1、si-Rab31-2和si-Rab31-3组神经胶质瘤细胞SHG-44中Rab31蛋白表达显著降低（P＜0.01）,其中si-Rab31-2组SHG-44细胞中Rab31表达最低;抑制Rab31表达可显著抑制SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭,并抑制SHG-44细胞中PI3K/AKT信号通路转导（P＜0.01）。结论:抑制Rab31可通过抑制PI3K/AKT信号通路转导抑制胶质瘤SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭。     

慢病毒介导ＲＮＡ干扰抑制脑胶质瘤细胞ＨＭＧＡ１表达对洛铂化疗敏感性的影响

目的：建立逆转录病毒介导入高迁移率族蛋白组Ａ１（ＨＭＧＡ１）基因ＲＮＡ干扰体外表达体系,并观察洛铂对脑胶质瘤细胞株ＳＨＧ-４４化疗敏感性的影响。方法：制备ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ慢病毒载体,ＰＣＲ筛选阳性克隆,测序鉴定;转染脑胶质瘤细胞株ＳＨＧ-４４后,ＲＴ-ＰＣＲ检测其对细胞ＨＭＧＡ１基因表达的影响;ＭＴＴ和克隆集落实验检测洛铂对阳性组和阴性组细胞生长、增殖的影响。结果：ＰＣＲ和测序证实,成功构建ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ的慢病毒载体;ＲＴ-ＰＣＲ证实阳性组细胞存在ＨＭＧＡ１基因表达下调;分别用不同浓度的洛铂处理两组细胞２４ｈ后,ＭＴＴ法和克隆集落实验显示阳性组细胞生长抑制率较阴性组细胞明显降低。结论：ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ能特异性下调脑胶质瘤细胞ＳＨＧ-４４中ＨＭＧＡ１的表达并抑制了其对洛铂的敏感性。     

PTEN在人脑胶质瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

背景与目的:PTEN基因的缺失及突变与多种肿瘤有关,而脑胶质瘤是与PTEN基因变异关系最为密切的恶性肿瘤之一.本研究旨在观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响,为PTEN用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据.方法:(1)应用RT-PCR方法扩增人脑胶质瘤细胞U251、SHG-44中PTEN基因,序列测定分析.(2)采用阳离子聚合物转染试剂,将携带野生型PTEN基因的重组真核表达载体质粒转染至胶质瘤细胞,G418筛选出稳定转染的细胞并扩增培养.通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN基因表达对细胞形态和增殖的影响,应用Western blot、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达.结果:(1)胶质瘤细胞U251和SHG-44的PTEN mRNA分别存在着突变型、缺失型两种表达方式.(2)稳定转染的U251和SHG-44细胞株的生长曲线显示细胞增殖明显受抑制,第7天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8%;Westem blot显示稳定转染细胞株有外源性PTEN蛋白的表达;细胞免疫化学法显示胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达量增加,从而表现出对细胞形态影响的差异,稳定转染的U251细胞出现向星形细胞分化的特征,SHG-44细胞形态转染前后无明显改变.结论:恢复野生型PTEN基因表达对胶质瘤细胞存在差异性的诱导分化作用.