SP2/0细胞膜抗原负载DC诱导体外特异性CTL效应

目的 研究SP2／0细胞膜抗原负载树突状细胞（DC）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的杀伤活性。方法 密度梯度离心法分离SP2／0细胞膜，负载经rmGM-CSF和rmIL-4诱导扩增的小鼠骨髓来源的DC，活化T淋巴细胞获得肿瘤特异性CTL，MTT法检测对SP2／0细胞的杀伤效果。结果 骨髓单个核细胞在rmGM-CSF和rmIL-4作用下获得了高表达CDS0、CD86和MHC-Ⅱ分子的DC，致敏的CTL对SP2／0骨髓瘤细胞具有高杀伤率，显著高于对I5178Y淋巴瘤细胞的杀伤活性（P〈0．01）。结论 SP2／0细胞膜抗原负载DC能诱导明显的特异性抗肿瘤免疫应答。     

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例明显增高 ,提示CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。     

人脐血树突状细胞分泌外来体的特性及其增强CTL杀伤活性的研究

目的探讨脐血树突状细胞(UBDC)及其分泌的亚细胞结构外来体(exosomes)的特性,以及他们对细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性的增强作用。方法分离脐血单个核细胞(UBMC),用rhSCF、rhGM-CSF及rhIL-4诱导12d,加入经反复冻融提取的肿瘤细胞膜抗原,继续培养2d。收集DC并从其培养上清中通过离心(1×105g)分离外来体。用流式细胞术、SDS-PAGE、透射电子显微镜(TEM)和MTT比色法,对DC和外来体的特性及其对CTL杀伤活性的增强作用进行分析。结果用3种细胞因子体外诱导UBMC12d,可使其扩增10倍,并出现DC典型的形态特征。负载肿瘤抗原后,细胞表面可高表达MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD11c和CD54。利用超速离心法能从DC培养上清中分离出外来体。混合淋巴细胞反应(MLR)和CTL杀伤活性的分析表明,脐血DC分泌的外来体能有效地刺激T细胞增殖并增强CTL的杀伤活性。结论由UBMC可诱导出大量的DC并分泌外来体。后者可有效地向CTL细胞递呈肿瘤抗原使之活化并增强其杀伤活性。     

树突状细胞体外诱导抗肿瘤血管内皮细胞特异性免疫的研究

目的:探讨肿瘤内皮细胞抗原负载的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤效应。方法:采用肿瘤细胞的培养上清诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖,制备肿瘤血管衍生的内皮细胞(TdEC)。用RTPCR检测肿瘤内皮标志物(TEM)的表达。制备TdEC的冻融抗原,负载从外周血中扩增的DC,用MTS比色法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖的效应;用LDH法检测DC诱导的CTL的特异性杀伤效应。结果:TdEC可表达TEM1和TEM8。负载TdEC抗原的DC,可显著刺激自体淋巴细胞增殖。由其诱导的CTL对TdEC具有特异性的杀伤作用。在效靶比为20∶1和10∶1时,杀伤率分别为33%和27%,高于对照组的14%和10%。结论:TdEC抗原负载的DC,在体外可有效地诱导CTL产生,并特异性地杀伤TdEC。     

不同大鼠胶质瘤抗原致敏的DC体外诱导CTL活性的研究

目的: 比较大鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells, DC)体外经由大鼠C6胶质瘤细胞由不同方式制备的不同抗原致敏后,对特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的诱导作用。方法: 自大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)+白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增;由C6胶质瘤细胞经由反复冻融、煮沸灭活及超声破碎细胞抽提其总蛋白的方法制备各种不同抗原致敏DC,致敏的DC与T淋巴细胞进行共培养诱导CTL;以ELISA法检测CTL诱导过程中淋巴细胞趋化因子(lymphocyte chemoattractant factor)及细胞因子IFN-γ分泌水平:以 -TdR掺入法检测DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。 结果: 体外应用煮沸灭活瘤细胞制备的肿瘤抗原致敏DC,能诱导更强的刺激T细胞增殖的能力、并且可以诱导杀伤活性更强的CTL。结论: 应用煮沸灭活的瘤细胞制备瘤抗原负载DC获得瘤苗可获得更强的抗肿瘤保护作用。     

肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究

目的:探讨Balb/c小鼠骨髓瘤SP2/0细胞冻融裂解物上清对SP2/0凋亡细胞负载的骨髓来源的树突状细胞(DC)的成熟、生物学特性及功能的影响。方法: 采用小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导骨髓来源的DC, 100Gyγ射线辐照诱导SP2/0细胞凋亡, 与未成熟DC共育16-20h;SP2/0细胞冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)分别作用于DC48h。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型;[³H]-TdR掺入试验和[⁵¹Cr]释放试验测定DC刺激T细胞增殖和细胞杀伤效应。采用腹股沟皮下DC主动免疫治疗SP2/0荷瘤小鼠, 每间隔14d治疗1次, 共3个疗程, 观察肿瘤生长情况及小鼠生存期。结果:(1)经SP2/0冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)诱导凋亡肿瘤细胞负载的DC高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子, 但抗原摄取能力均下降;(2)SP2/0冻融裂解物上清组和LPS组DC体外刺激T细胞增殖和激活CTL能力均高于对照组(P＜0.05);(3)经SP2/0冻融裂解物上清组主动免疫治疗小鼠存活期长于其它各组(P＜0.05)。结论:小鼠SP2/0细胞冻融裂解物上清可诱导凋亡细胞负载的树突状细胞成熟, 能够刺激T细胞增殖和激发肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL), 主动免疫治疗可激发荷瘤小鼠体内有效的肿瘤特异性免疫力, 延长荷瘤小鼠生存期。     

卵巢癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞诱导CTL抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究卵巢癌冻融抗原负载的树突状细胞(dendriticcells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤卵巢癌细胞的细胞毒性效应。方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法从卵巢癌细胞系SKOV3中提取的可溶性相关抗原负载DC。流式细胞学检测负载抗原后DC表面各种分化相关抗原的表达,ELISA法检测DC上清中IL12的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的抗原特异性CTL对卵巢癌细胞的杀伤作用。结果与未经抗原负载的DC相比,经卵巢癌抗原负载的DC不仅能更高地表达各种DC分化相关抗原CD1α(73.35%±2.94%vs34.1%±2.35%)、CD83(73.9%±8.46%vs54.68%±3.26%)、CD80(91.95%±2.48%vs52.53%±3.18%)、HLADR(70.05%±2.35%vs48.7%±2.07%)以及CD54(88.9%±5.52%vs71.45%±2.29%),同时具有更强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖和IL12分泌的能力(P均<0.05)。此外,卵巢癌细胞SKOV3冻融抗原负载DC激活的CTL在体外对SKOV3的杀伤率为77.35%,显著高于未经抗原负载的DC(P=0.0001)。结论经卵巢癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力和杀伤卵巢癌细胞的作用。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

体外培养系统中各细胞组分在IL-18诱导的肿瘤特异性CTL中的作用

应用rhIL 18在体外培养系统 (coculturesysteminvitro ,CCS )中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxicTlympho cyte ,CTL ) ,探索不同细胞在IL 18起动和促进肿瘤特异性免疫应答方面的作用。采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞 (DC ) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,12 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果表明 ,在肿瘤抗原存在的条件下 ,CCS中rhIL 18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应 ;并且 ,在rhIL 18诱导肿瘤特异性CTL的过程中 ,rhIL 18、NK细胞、DC及T细胞均起着十分重要的作用 ,缺少任一组份 ,均对诱导肿瘤特异性CTL有明显差异 (P <0 0 1)。提示在CCS中 ,rhIL 18诱导的NK细胞快速杀伤效应及DC的抗原提呈作用 ,在肿瘤特异性CTL产生过程中 ,均起着决定性的作用。     

两种白血病细胞抗原负载DC的体外诱导特异性CTL应答的比较

目的: 比较树突状细胞 (DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力。方法: 采用羟乙基淀粉 Ficoll两步法分离外周血单个核细胞(PBMC), 通过贴壁 2h获得黏附的单核细胞, 用GM- CSF加IL- 4诱导培养 5d收获细胞。将细胞分为 4组: A组将K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在 500g/LPEG 100mL/LDMSO诱导下与DC融合; B组加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原; C组将K562细胞或CML细胞与DC共培养; D组: 单独DC培养组。融合前以红色荧光染料PKH26标记K562细胞, 采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26 /FITC 抗HLA ABC抗体双标细胞并评估融合率。培养的第 6天, 加入TNF -α诱导DC成熟, 然后分别与自体T细胞共培养, 用MTT比色法检测各组CTL对靶细胞的杀伤活性。结果: GM- CSF加IL -4和TNF- α依次诱导成熟的DC具有经典的DC的形态和表型特征, 在PEG -DMSO的介导下, DC与白血病细胞的融合率为 ( 17. 33 ~29. 94 )%。两种抗原负载方案激活的CTL均对表达K562抗原的细胞具有特异性的细胞毒作用。在效靶比相同时, 融合组诱导CTL的杀伤活性强于冻融抗原致敏DC组。结论: 与冻融抗原致敏的DC相比, DC与白血病细胞融合细胞递呈抗原的效率更高, 体外诱导的CTL特异性杀伤靶     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒修饰DC体外诱导特异性T细胞免疫的研究

目的 了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(AdSF35-LMP2)修饰的DC能否在体外诱导LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫.方法 人外周血单个核细胞在细胞因子诱导下生成树突状细胞,Ad5F35-LMP2感染树突状细胞后激发同源的T细胞,MTT法检测其对T细胞的增殖作用,及激活的特异性CTL对表达LMP2的人CNE-2细胞的特异性杀伤效应.结果Ad5F35-LMP2能有效感染树突状细胞.其激活的特异性CTL对CNE-2细胞有特异性杀伤活性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 重组腺病毒Ad5F35-LMP2感染的DC可以有效的诱导产生EBV-LMP2特异性细胞毒效应.     

Artificial human antigen‐presenting cells are superior to dendritic cells at inducing cytotoxic T‐cell responses

Peptide recognition through the MHC class I molecule by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) leads to the killing of cancer cells. A potential challenge for T‐cell immunotherapy is that dendritic cells (DCs) are exposed to the MHC class I–peptide complex for an insufficient amount of time. To improve tumour antigen presentation to T cells and thereby initiate a more effective T‐cell response, we generated artificial antigen‐presenting cells (aAPCs) by incubating human immature DCs (imDCs) with poly(lactic‐co‐glycolic) acid nanoparticles (PLGA‐NPs) encapsulating tumour antigenic peptides, followed by maturation with lipopolysaccharide. Tumour antigen‐specific CTLs were then induced using either peptide‐loaded mature DCs (mDCs) or aAPCs, and their activities were analysed using both ELISpot and cytotoxicity assays. We found that the aAPCs induced significantly stronger tumour antigen‐specific CTL responses than the controls, which included both mDCs and aAPCs loaded with empty nanoparticles. Moreover, frozen CTLs that were generated by exposure to aAPCs retained the capability to eradicate HLA‐A2‐positive tumour antigen‐bearing cancer cells. These results indicated that aAPCs are superior to DCs when inducing the CTL response because the former are capable of continuously presenting tumour antigens to T cells in a sustained manner. The development of aAPCs with PLGA‐NPs encapsulating tumour antigenic peptides is a promising approach for the generation of effective CTL responses in vitro and warrants further assessments in clinical trials.     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

热处理淋巴瘤细胞增强树突状细胞介导的抗瘤效应研究

目的:探讨淋巴瘤细胞热处理后作为抗原,冲击树突状细胞而引发的抗淋巴瘤免疫效应。方法:用健康人外周血分离出单核细胞,体外培养树突状细胞(Dendritic cells,DCs),将淋巴瘤细胞株热处理(42℃,2小时)培养24小时后负载于DCs,在流式细胞仪上检测DCs的免疫表型变化;负载抗原后的DCs与淋巴细胞混合反应,以MTT法评价细胞毒性及在流式细胞仪上检测淋巴细胞的免疫表型;ELISPOT法检测细胞内因子IFNγ-的释放。结果:在两实验组中,DCs负载了热处理的淋巴瘤抗原后,细胞表面的共刺激分子和MHCⅡ类分子表达水平较对照组明显增加(P0.05),而两组之间差别无显著性(P0.05);经热处理的肿瘤细胞负载于DCs后,与淋巴细胞混合后IFNγ-的释放量明显增加;混合淋巴细胞反应后,细胞毒性实验(MTT法)和流式细胞仪检测结果均显示两实验组的杀瘤作用强于对照组(P0.05),两组之间无显著差别(P0.05)。结论:用热处理的淋巴瘤细胞作为肿瘤抗原冲击DC,能够增强抗淋巴瘤效应。     

WT1多肽致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞实验研究

目的：研究来自健康人外周血单个核细胞的树突状细胞（DC）负载WT1多肽抗原，体外诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对K562细胞的杀伤作用。 方法： 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，自外周血单个核细胞诱导扩增，培养出DC，使DC负载WT1多肽抗原。实验分3组，WT1多肽致敏DC为实验组A，未致敏DC为实验组B，单纯自体淋巴细胞未加DC激活为对照组C，观察CTL对K562细胞的杀伤作用。 结果： 培养出具有典型特征的DC，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时，实验组A诱导的CTL对K562细胞的杀伤率为86.1%±26.8%；实验组B为47.1%±20.8%；对照组C为27.7%±15.3% (P＜0.05)。 结论： WT1多肽抗原致敏DC能促使CD8阳性淋巴细胞扩增，并诱导激活特异性CTL，对K562靶细胞具有明显的杀伤作用。     

DC—LMP2与rAd—LMP2所诱导的细胞免疫应答效果研究

目的比较DC-LMP2与rAd—LMP2在BALB／c小鼠中的免疫效果。方法从BALB／c小鼠中分离骨髓细胞,在细胞因子作用下体外诱导培养获得小鼠树突状细胞（mDC）,再以100MOI的含EB病潜伏膜蛋白2的重组腺病毒（rAd—LNP2）感染,获得DE—LNP2,免疫酶法确定LMP2在DC中表达。于0,2,4周,分别以PBS、DC-LMP2和rAd-LMP2肌肉免疫BALB／c小鼠,第5和8周检测小鼠体内LMP2特异性细胞应答水平。结果骨髓细胞体外成功诱导获得DC,LMP2在DC中表达。DC—LMP2和rAd—LMP2均可诱导LMP2特异性细胞免疫应答,随时间推移而减弱。rAd—LMP2诱导特异性细胞免疫应答水平高于DC—LMP2。结论肌肉免疫rAd—LMP2能够在BALB／c小鼠中诱导较强的LMP2特异性细胞免疫应答。