构建P16慢病毒载体永生化心肌干细胞的探讨

目的：构建P16慢病毒载体,为修复坏死心肌干细胞提供理论基础。方法构建 pLVX p16ink4a ZsGreen、pLVX P16INK4a慢病毒载体,将P16目的基因转导入目标细胞。利用倒置免疫荧光显微镜观察携带绿色荧光蛋白的 pLVX p16ink4a ZsGreen阳性转导细胞的变化,并通过β半乳糖苷酶染色鉴定观察 pLVX P16INK4a 转导阳性细胞即衰老细胞的变化。利用Western blotting法测定P16目的基因转导成功后蛋白变化水平。结果携带绿色荧光蛋白的 pLVX P16ink4a ZsGreen阳性转导细胞传代增殖受到抑制,β半乳糖苷酶染色鉴定观察 pLVX P16INK4a转导阳性细胞即衰老细胞增殖受到抑制,上述两种阳性转导细胞在细胞培养传代过程中被稀释。Western blotting法测定p16INK4a蛋白水平也存在稀释变化。结论构建P16慢病毒载体转导目标细胞传代培养过程中,目的基因P16在细胞传代增殖过程中存在抑制作用,并可导致转导阳性细胞稀释。     

人乳头状瘤病毒在食管癌中的表达及其作用

背景：人乳头状瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌和口腔鳞状细胞癌的发生密切相关，但其与食管癌的关系及其所致相关基因表达的变化尚不十分清楚。目的：研究HPV在食管癌中的表达，探讨其对相关基因蛋白表达的影响。方法：以DNA原位杂交法检测HPV16基因的表达，以免疫组化方法检测HPV16E。突变型p53、p21WAF1、pRb和p16INK4a蛋白的表达。结果：食管癌组织中HPV16DNA的阳性率显著高于正常对照组（65．6％对10．0％，P〈0．001），HPV16E。蛋白的表达率亦显著高于正常对照组（58．9％对15．0％，P〈0．001）；突变型p53蛋白的表达率显著高于正常对照组（53．3％对45．0％，P〈0．05），p21WAF1、pRb和P16INK4a蛋白的表达率则显著低于正常对照组（22．2％对65．0％、23-3％对55．0％和35．6％对85．0％，P〈0．001）。食管癌组织中HPV16E。蛋白与突变型p53蛋白的表达呈正相关，与p21WAF1、pRb和p16INK4a蛋白的表达呈负相关（P〈0．01）。结论：HPV感染是食管癌发生的重要危险因素之一，其可能通过p53突变和p21WAF1、pRb、p16INK4a失活参与了食管癌的发生。     

宫颈病变组织中Vimentin、P16INK4A、Smad4的定位、表达及其在EMT中的作用

目的 观察Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈癌及前期病变中的定位与表达水平,探讨其对宫颈癌细胞上皮—间质转化（EMT）的影响和可能机制.方法 免疫组织化学染色方法检测30例慢性子宫颈炎、30例低级别宫颈上皮内瘤变（CIN）、30例高级别CIN和30例宫颈癌中Vimentin、P16INK4A和Smad4的表达水平和定位.结果 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宫颈病变组织中呈不同程度阳性表达,在细胞质和细胞核均可表达.宫颈癌组织Vimentin 表达水平较慢性子宫颈炎、低级别CIN、高级别CIN高（P均＜0.01）.慢性子宫颈炎组织中P16INK4A阴性表达,在CIN和宫颈癌组织中表达水平升高（P均＜0.01）.慢性子宫颈炎组织中Smad4在细胞核与细胞质均高表达,低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织中Smad4细胞核表达水平降低（P均＜0.01）.Spearman相关分析显示,120例宫颈病变组织中Smad4核表达与P16ININKA核质表达均呈负相关（r分别为-0.274、-0.387,P均＜0.01）,Smad4核表达与Vimentin核表达亦呈负相关（r=-0.209,P＜0.05）,P16INK4A核质表达与Vimentin核表达均呈正相关（r分别为0.334、0.443,P均＜0.01）.宫颈癌中Vimentin、P16INK4A和Smad4无论细胞核表达或细胞质表达均与宫颈癌的分化和年龄无相关关系（P均＞0.05）.结论 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宫颈病变组织细胞质和细胞核中呈不同程度阳性表达.Vimentin核表达是反映宫颈癌细胞EMT的良好指标,P16INK4A核表达和Smad4核表达与宫颈癌细胞EMT密切相关.     

非小细胞肺癌11个肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化的研究

目的观测11个基因在非小细胞肺癌中的甲基化谱,探讨肺癌基因诊断的新途径.方法应用甲基化特异性的PCR（methyl-specific PCR,MSP）.方法检测甲基化率,回收产物测序.结果11个基因中有6个基因在癌组织中的甲基化率均＞40%并且高于癌旁组织,6个基因的甲基化率分别是APC 61%,RASSF1a 55%,p73 45%,p16INK4a 43%,CDH13 43%及RAR-β 41%,＞65岁组RASSF1a、p16INK4a和RAR-β甲基化率高于≤65岁组;吸烟史组APC、RASSF1a、p16INK4a和CDH13的甲基化率高于无吸烟史组;腺癌组APC、CDH13和RAR-β甲基化率高于鳞癌组,而鳞癌组p16INK4a甲基化率高于腺癌组;RASSF1a和p16INK4a甲基率随TNM 临床分期而逐渐增加.结论6个基因甲基化率的发生具有肿瘤特异性,并且相关基因的甲基化与NSCLC患者的病理生理密切相关,我们的研究为早期诊断NSCLC提供帮助.     

胃癌形成过程中p16IN4a、Runx3和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因甲基化及其表达研究

目的 研究胃癌形成过程中p16INK4a、Runx3和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区的高甲基化状态,同时检测MGMT的蛋白表达情况.探讨抑癌基因启动子区高甲基化与胃癌发生的关系.方法 选择经透明帽法进行首次黏膜病变切除者43例,其中异型增生27例,早期胃癌16例.选择胃镜活检证实为慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生者14例.另取20例正常胃黏膜活检组织作为对照.采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测每例组织中p16INK4a、Runx3和MGMT基因启动子区的甲基化状态,对所有甲基化p16INK4a产物进行测序,免疫组化检测MGMT蛋白表达情况.结果 肠上皮化生、异型增生和早期胃癌中p16INK4a基因甲基化率依次为14.3%(2/14)、22.2%(6/27)和37.5%(6/16);Runx3基因甲基化率依次为14.3%(2/14)、48.1%(13/27)和50.0%(8/16);MGMT基因甲基化率依次为7.1%(1/14)、48.1%(13/27)和50.0%(8/16).20名正常对照均未检出基因甲基化,与异型增生和早期胃癌相比差异有统计学意义(P＜0.05).Runx3和MGMT两种基因在异型增生和早期胃癌中的甲基化率显著高于肠上皮化生组(P＜0.05).各组病变中三种基因甲基化联合分析发现,异型增生和早期胃癌中甲基化的基因种类高于肠上皮化生组.差异有统计学意义(P＜0.01).基因甲基化与息者年龄、性别、幽门螺杆菌感染以及病变部位无相关性,但p16INK4a和MGMT基因甲基化与血清癌胚抗原水平升高显著相关(P值分别为0.003和0.039).MGMT基因启动子区高甲基化与其蛋白失表达密切相关(χ2=12.821,P=0.001).结论 抑癌基因启动子区高甲基化是基因失活的主要机制,可能是胃癌发生的早期分子事件.p16INK4a、Runx3和MGMT基因启动子区高甲基化在胃癌形成过程中起着重要的作用.     

P16INK4A在宫颈癌及癌前病变的表达及临床意义

采用免疫组织化学技术SP法检测31例宫颈癌(UCC)、31例宫颈上皮内瘤变(CIN)、10例宫颈炎标本中P16INK4A表达情况.发现P16INK4A在上述3种组织中均有表达,且表达阳性率逐渐降低,分别为100.00%、74.19%、30.00%,且其表达与UCC病理分级和肌层浸润程度有关.提示P16INK4A的检测可提高对宫颈癌前变及UCC的早期诊断率.     

KiSS-1、P16INK4A及Ki67在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的探讨KiSS-1、P16INK4A及Ki67在正常宫颈黏膜上皮、宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈鳞癌组织中的表达及意义。方法采用免疫组化SP法检测40例正常宫颈黏膜上皮、40例CIN及40例宫颈鳞癌组织中KiSS-1、P16INK4A及Ki67的表达。结果 KiSS-1、P16INK4A及Ki67在正常宫颈黏膜上皮的阳性表达率为85.00%、62.50%、29.70%,CINⅡ~Ⅲ为10.00%、65.00%、87.50%,宫颈鳞癌为8.00%、40.00%、95.00%;KiSS-1蛋白失表达与宫颈鳞癌的浸润深度及淋巴结转移有关（P〈0.05）,P16INK4A及Ki67的高表达与宫颈鳞癌的浸润深度及淋巴结转移有关（P〈0.05）;宫颈鳞癌组织中KiSS-1和P16INK4A、Ki67的表达具有相关性（P〈0.01）。结论 KiSS-1低表达和P16INK4A、Ki67过表达与宫颈癌的发生、发展、浸润及转移有关,联合检测KiSS-1、P16INK4A及Ki67的表达可以在一定程度上预测宫颈癌患者预后并指导治疗。     

Bmi-1基因对胃癌细胞增殖的影响及机制

目的:探索干扰Bmi-1基因后对其可能的下游基因Akt/PKB活性和P16INK4a基因表达的影响及对肿瘤细胞增殖和细胞衰老的作用.方法:用s iRNA技术干扰Bmi-1表达后,运用Western blot检测Bmi-1蛋白及相关蛋白pAkt、Akt和P16INK4a的表达,同时进行SA-β-Gal染色检测细胞衰老,软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力.结果:转染Bmi-1 i质粒组平均细胞衰老率28%±3.5%,而对照Ctrl i组为16%±2.7%,有明显统计学差异( P<0.01).转染Bmi-1 i质粒组细胞平均克隆形成数为3.4±1.4个,而对照Ctrl i组为11±2.3个,两组比较有明显的统计学差异( P<0.01).Bmi-1 i 组较Ctrl i 组Bmi-1和pAkt蛋白表达明显下降,而P16INK4a蛋白表达升高.结论:干扰Bmi-1可以通过降低Akt/PKB活性和上调P16INK4a蛋白表达,促进肿瘤细胞衰老并减弱肿瘤细胞的增殖能力.     

肺癌INK4a/ARF基因缺失与突变研究进展

INK4a/ARF基因位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21),是近期发现的新型抑癌基因,其编码产物分别为p16~(INK4a)和p14~(ARF),它们在细胞增殖周期中起负调控作用 本文综述了肺癌INK4a/ARF基因的结构和功能状态,提示该基因异常是肺癌的又一重要分子标志。肺癌INK4a/ARF基因功能的失活,与该基因位点的纯合或杂合缺失、点突变和5＇-CpG岛异常甲基化密切相关     

041 肺癌INK4a/ARF基因缺失与突变研究进展

INK4a/ARF基因位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21),是近期发现的新型抑癌基因,其编码产物分别为p16IINK4a和p14ARF,它们在细胞增殖周期中起负调控作用.本文综述了肺癌INK4a/ARF基因的结构和功能状态,提示该基因异常是肺癌的又一重要分子标志.肺癌INK4a/ARF基因功能的失活,与该基因位点的纯合或杂合缺失、点突变和5-CpG岛异常甲基化密切相关.     

痰液、血液和纤维支气管镜活检组织中P16INK4a基因甲基化与临床肺癌诊断的关系

目的探讨血液、痰液和纤维支气管镜活检组织中的P16INK4a基因甲基化与临床肺癌诊断的关系。方法运用甲基化特异度聚合酶链技术(methylation-specific PCR,MSP)检测40例临床诊断肺癌患者和45例一般呼吸道疾病患者血液、纤维支气管镜活检组织和痰液标本中P16INK4a的甲基化状况。比较单一组织来源标本检测和多种组织来源标本联合检测诊断肺癌的诊断特性。结果肺癌患者单一血液、痰液和纤维支气管镜活检组织来源标本中甲基化阳性率分别为54.54%(18/33)、65.00%(13/20)和71.43%(10/14);一般呼吸道疾病患者的单一血液、痰液和纤维支气管镜活检组织来源标本中的甲基化阳性率分别为18.18%(6/33)、23.08%(3/13)和23.53%(4/17);两者比较差异显著(P<0.05);肺癌患者多种组织来源标本联合检测甲基化阳性率为85.00%,和前二者比较差异有显著性(P<0.05)。联合检测诊断试验的准确率为84.71%,阳性预测值82.93%,阴性预测值86.36%,阳性似然比为5.46,阴性似然比0.18。结论肺癌患者痰液、血液和纤维支气管镜活检组织中P16INK4a基因甲基化有助于肺癌诊断,对同一患者获取多种组织来源标本联合检测,可提高检测阳性率。     

甲状腺乳头状癌组织中p14~（ARF）、p16~（INK4a）、MDM2的表达变化及意义

目的观察甲状腺乳头状癌（PTC）组织中p14ARF、p16INK4a、MDM2的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测83例PTC、31例甲状腺乳头状微小癌（PTMC）、50例甲状腺腺瘤组织中的p14ARF、p16INK4a、MDM2。结果 PTC组织中p14ARF、p16INK4a、MDM2蛋白阳性率分别为22.9%、26.5%、74.7%,PTMC组织中分别为45.2%、48.4%、54.8%,甲状腺瘤组织中分别为52.0%、72.0%、52.0%。PTC组织中p14ARF、p16INK4a蛋白阳性率明显低于甲状腺腺瘤（P〈0.01）及PTMC（P〈0.05）,MDM2蛋白阳性率明显高于甲状腺腺瘤（P〈0.05）及PTMC（P〈0.01）。p14ARF蛋白表达与PTC淋巴结转移有关（P〈0.05）,p16INK4a蛋白表达与PTC复发有关（P〈0.05）。p14ARF、MDM2蛋白表达呈负相关（r=-0.343,P〈0.05）。结论 PTC组织中p14ARF、p16INK4a蛋白表达降低、MDM2蛋白表达增高可能在PTC发生发展中起重要作用,联合检测有助于PTC生物学行为的判定。     

抑癌基因P16与胶质瘤基因治疗的研究现状

Serrano等在研究与细胞周期依赖性激酶4(CDK4)结合蛋白时，从SV40抗原转化人肺纤维细胞中发现并分离了特异性CDK4抑制蛋白，即P^16蛋白(P^16INK4a)。随着研究的深入，现已证明P^16是专职调控细胞周期的抑癌基因，且是第1个直接调控细胞周期的新抑癌基因。近年来，P^16基因与胶质瘤基因治疗的研究有较大进展，现结合文献综述如下。     

Human papillomavirus DNA and P16(INK4A) expression in concurrent esophageal and gastric cardia cancers

AIM:To investigate the relationship between human papillomavirus (HPV) infection and concurrent esophagus and gastric cardia cancer from the same patient (CC) and examine the significance of P16 INK4A protein expression.METHODS:Polymerase chain reaction was used to detect the presence of HPV type16 (HPV16).The expression of P16 INK4A protein was detected using immunohistochemistry.RESULTS:Among the CC specimens,HPV16-DNA was found in eight cases of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and five cases of gastric cardia adenocarcinoma (GCA),respectively (47% vs 29%),and two of both ESCC and GCA.P16 INK4A was highly expressed in both ESCC and GCA.In the HPV-associated positive CC,higher P16 INK4A expression was observed in the GCA than in the ESCC (75% vs 25%,P < 0.05).CONCLUSION:HPV16 as a correlated risk factor may play an important role in the development of ESCC and GCA.P16 INK4A may be a screening index in the HPVassociated carcinoma of gastric cardia.     

P16基因甲基化与消化系统恶性肿瘤

P16基因又称多肿瘤抑制因子1(MTSl)、CDK4抑制因子(INK4),是1993年发现并克隆出的一个参与细胞周期调控的抑癌基因。由于其作用和重要性不亚于P53基因,因而成为近年来研究的热点。     

骨髓增生异常综合征的免疫表型和SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因表达

目的探讨骨髓增生异常综合征（MDS）特征性免疫表型,SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因表达程度,及其与临床病情进展的关系。方法抽取50例MDS患者骨髓细胞,用流式细胞学技术检测免疫表型;抽取单个核细胞,用RT-PCR方法检测SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表达程度。结果与对照组相比,MDS患者骨髓细胞原始群CD7和CD34表达增多;粒细胞群CD34表达增多,CD13、CD33、CD11b表达下降;单核细胞表达CD117和CD34。与对照组相比,MDS患者骨髓单个核细胞SURVIVIN和TRF1基因mRNA表达增加,P15INK4B基因mR-NA表达下降（P均〈0.05）。从低危组到高危组,SURVIVIN和TRF1基因mRNA表达增加,P15INK4B基因mRNA表达下降（P均〈0.05）。结论 MDS免疫表型有其特征性,SURVIVIN、P15INK4B和TRF1基因表达可能与其发病进展有关。     

p16和Ki67在宫颈癌癌前病变及宫颈癌中表达及其与HPV感染的相关性

目的观察宫颈癌前病变与宫颈癌老年患者p16、Ki67表达情况及乳头瘤状病毒(HPV)感染情况,分析p16、Ki67与宫颈癌前病变及宫颈癌老年患者HPV感染的相关性。方法选择经刮诊或手术病理证实的宫颈癌前病变老年患者100例作为宫颈癌前病变组,同期经刮诊或手术病理证实的宫颈癌老年患者60例作为宫颈癌组,同期在院接受治疗的宫颈炎患者60例作为宫颈炎组,全部患者采用免疫组织化学染色法测定p16、Ki67蛋白阳性表达情况,同时检测并比较宫颈癌前病变与宫颈癌组HPV感染率。经Spearman相关性分析检验p16、Ki67蛋白表达与宫颈癌前病变、宫颈癌患者HPV感染的相关性。结果三组研究对象中,宫颈癌组p16、Ki67蛋白阳性率、HPV感染率最高,其次为宫颈癌前病变组,宫颈炎组最低,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)经等级Spearman相关性检验证实,p16、Ki67蛋白表达与宫颈癌前病变及宫颈癌患者HPV感染均呈正相关(r=0.744、0.561,P均<0.05)。结论宫颈癌前病变与宫颈癌患者p16、Ki67蛋白呈高表达,且与患者HPV感染明显相关,随着p16、Ki67蛋白表达升高,患者感染HPV风险增加,未来可考虑将p16、Ki67蛋白的动态监测结果作为宫颈癌前病变及宫颈癌早期筛查与诊断的主要生物学标志物。     

Valsartan延缓血管内皮细胞衰老及p16INK4a表达变化的研究

目的 探讨Valsartan对血管内皮细胞衰老与p16INK4a表达变化的影响,为寻求廷缓内皮细胞衰老途径提供理论和实验依据.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,子血管紧张素Ⅱ及Valsartan干预,实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ诱导组及Valsartan组,采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定细胞衰老;流式细胞术分析细胞周期变化;免疫细胞化学染色法、Western blot分析各组细胞p16INK4a蛋白的表达.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ诱导组β-半乳糖苷酶阳性染色率显著增多81.24％±6.46％,细胞周期停滞于G0-G1(88.36％±6.45％),p16INK4a 蛋白表达水平上调(P＜0.05);予以Valsartan干预后,β-半乳糖苷酶阳性细胞染色率减少,G0-G1细胞减少,p16INK4a蛋白表达水平下调(P＜0.05).结论 血管内皮细胞衰老分子机制可能通过下调p16INK4a的表达,使细胞周期停滞于G1期有关,Valsartan对血管内皮细胞衰老有一定保护作用,可能通过调控p16INK4a的表达发挥其延缓3血管内皮细胞衰老的作用.     

p16INK4a基因通过非周期依赖作用促进心脏成纤维细胞纤维化蛋白表达

目的:探究p16INK4a基因在转化生长因子-β1 (TGF-β1)介导的促心肌纤维化中的作用及机制.方法:在人原代心脏成纤维细胞中转染p16INK4a过表达腺病毒,TGF-β1刺激并检测胶原蛋白(Collagen)Ⅰ、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨膜蛋白(POSTN)蛋白表达水平.其次,TGF-β1刺激细胞后,...     

MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达的影响

目的 观察细胞外信号调节激酶信号通路(MEK)抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关的抑癌基因表达的影响。方法 培养人胰腺癌细胞系CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2,应用50μmol/L的MEK抑制剂PD98059处理细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR法检测p16INK4a、p21 WAF1和p27KIP1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测DNA甲基化酶(Dnmt)1、3a和3b表达,甲基化特异性PCR(MSP)分析p16INK4a基因启动子甲基化状况。结果 PD98059处理24h后,CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2细胞的增殖抑制率分别为69％、78％和45％;G0/G1期细胞比例分别从(68.21±0.73)％、(56.54±0.68)％、(54.89±0.79)％增加到(80.37±0.65)％、(72.05±0.52)％、(79.21±0.93)％(P值均＜0.05);S期和G2/M期细胞比例相应减少。PD98059处理后,CFPAC1、PANC1细胞p27KIP1、p21WAF1和p16INK4a mRNA表达增加,Dnmt1和Dnmt3b蛋白表达减少;p16INK4a启动子甲基化状态被去除。而MiaPaCa2细胞仅p27KIP1 mRNA表达增加;p21WAF1、p16INK4a mRNA和Dnmt表达均无明显变化。结论 MEK通路抑制剂可能通过下调DNA甲基化酶、上调细胞周期相关抑癌基因表达而抑制胰腺癌细胞周期进展和细胞增殖。