TAK1在胶质细胞iNOS表达中的作用机制

目的：研究探讨中枢胶质细胞在炎症反应过程中,转化生长因子β（TGFβ）-激活性激酶1（TAK1）诱导iNOS表达的作用机制。方法：通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的激活蛋白因子（TAK1-binding proteinlTAB1）,或与iNOS启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒及NFKB-Luc质粒共转染。结果：TAK1明显激活iNOS的表达活性。而且当使用下游激酶p38MAPK,JNK和NFKB的抑制剂（SB203580,SP600125和CAPE）后,这些表达活性明显被抑制。结论：在胶质细胞内,TAK1在p38 MAPK,JNK和NFκB信号传导途径介导的iNOS的转录表达活性中起着非常重要的作用。     

加味丹参饮抑制p38MAPK表达保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞损伤的实验研究

目的 观察加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)乳鼠心肌细胞p38 MAPK蛋白表达的影响, 以探讨其保护心肌的作用机制. 方法 将20只SD乳鼠的心肌细胞进行原代培养, 建立H/R模型并随机分为H/R组、SB203580 (p38MAPK阻断剂组)、加味丹参饮含药血清组,正常心肌细胞组作为对照组. 采用T淋巴细胞化学染色法鉴定心肌细胞,罗丹明B(Rhodamine B)染色法观察细胞形态,MTT 比色法检测含药血清对乳鼠心肌细胞的毒性,Western-blot 法检测MKK3 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶3)、MKK6 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶6)、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表达. 结果 与正常血清对照组比较,H/R组MKK3、MKK6的蛋白表达增多,p38MAPK通路阻断剂SB203580和加味丹参饮均不能减少其表达;p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R 时表达均增加(P<0.01),而SB203580 和加味丹参饮含药血清均能减少其表达(P<0.01). 结论 加味丹参饮含药血清预处理可通过抑制缺氧,复氧心肌细胞p38MAPK信号通路发挥保护作用,抑制p38MAPK表达及其磷酸化,减轻心肌细胞损伤,起到保护心肌细胞的作用.     

Bcl3 与成人T 细胞白血病

Bcl3(B-cell CLL/lymphoma 3)是一个原癌基因,也是IκB蛋白家族成员,它和核转录因子κB(NFκB)通路的关系密切,根据现有研究结果,作者提出如下假设:(1)人类T细胞白血病1型(HTLV-1)病毒感染后,Tax蛋白首先激活NFκB通路,NFκB激活后再促进Bcl3的基因转录,高表达的Bcl3通过和p50或p52同源二聚体结合,促进NFκB的活性,这样就形成了不依赖于Tax蛋白的正反馈调节环。(2)在成人T细胞白血病(ATL)细胞中Tax基因表达很低的原因是高表达的Bcl3对Tax基因表达抑制的结果。     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

消瘤方对子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞NF-κB/MAPK信号通路的影响

目的:探讨中药消瘤方对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者在位和异位内膜基质细胞核转录因子(NF)-κB/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法:采用改良筛网法原代分离、培养EMs患者在位、异位及正常人子宫内膜基质细胞;将分离出的子宫内膜细胞分为正常组、在位组和异位组,其中在位和异位组再随机分为空白对照组(生理盐水组)、西药对照组(孕三烯酮组)、中药低剂量组(消瘤方提取物5 g/L组)及高剂量组(消瘤方提取物10 g/L组),各组分别加入相应药物干预后采用RT-PCR方法检测内膜细胞NF-κB/MAPK因子的表达水平。结果:药物干预后发现,消瘤方高剂量组和西药组可抑制在位及异位子宫内膜细胞的NF-κB/MAPK p38信号因子的激活,降低NF-κB/MAPK p38因子的表达,差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。结论:子宫内膜异位症的发生与NF-κB/MAPK信号通路的激活密切相关,消瘤方可通过抑制子宫内膜细胞NF-κB/MAPK信号通路因子的表达,从而阻止内异灶的形成而起到治疗的作用。     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。     

调控高迁移组蛋白1诱导大鼠肺泡巨噬细胞表达诱生型一氧化氮合酶的信号通路

目的观察细胞外信号调节激酶(ERK)、p38分裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)及核因子-κB(NF-κB)在高迁移组蛋白1(HMGB1)诱导大鼠肺泡巨噬细胞表达诱生型一氧化氮合酶(iNOS)中的作用。方法体外培养的大鼠原代肺泡巨噬细胞(PRAMs)分别与ERK抑制剂PD98059、p38MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC,以及PD98059联合SB203580共孵育2h后,培养基中分别加入重组人HMGB1作用6h。采用逆转录聚合酶链式反应检测培养细胞中iNOSmRNA表达,用Greiss法测定培养上清中NO2-/NO3-的含量。结果PD98059、SB203580和PDTC均可显著下调HMGB1诱导PRAMs表达iNOSmRNA和产生NO(P<0·05)。联合使用PD98059和SB203580可增强抑制iNOSmRNA表达和NO产生(P<0·05)。结论信号分子ERK、p38MAPK和NF-κB均参与了HMGB1诱导大鼠肺泡巨噬细胞表达iNOS和产生NO。     

p38MAPK对大鼠肾小球系膜细胞表达NF-κB和COX-2的调控

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB ) 和环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2)之间的关系,从而研究p38MAPK和NF-κB、COX-2在糖尿病肾病中的作用机制.方法:分别以一定浓度的高葡萄糖(25 mmol/L)、高胰岛素(100 mmol/L)、过氧化氢(100 μmol/L)和糖基化终产物(100 mg/L)孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1一定时间;先分别以一定浓度的p38MAPK特异抑制剂SB203580(10 μmol/L)预处理细胞系HBZY-1,再给予上述4种因素孵育细胞系HBZY-1,观察细胞系HBZY-1 p38MAPK、NF-κB和COX-2的表达.结果:高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物均可独立激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,NF-κB、COX-2表达也明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);SB203580预处理后,NF-κB、COX-2表达显著降低,与相应刺激组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:p38MAPK可通过激活NF-κB、COX-2而诱导DM时肾脏的损害, p38MAPK和NF-κB、COX-2在糖尿病肾病的发生发展过程中可能起重要作用.     

哺乳动物的促分裂原活化蛋白激酶信号途径

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类表达于所有真核细胞的丝氨酸/苏氨酸激酶,能够被诸如细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应急以及细胞粘附等各种刺激因素激活.MAPK途径的基本组合包括MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPK激酶激酶(MKKK)三种保守的成分,由此建立一个连续的激活途径.哺乳动物的MAPK可以大致归纳为5类:ERK1/2(MAPKerk1/2)、P38(MAPKp3g)、JNK(MAPKjnk)、ERK3/4(MAPKerk3/4)和ERK5(MAPKerk5).MAPK家族在各种细胞活动中具有重要作用,如增殖、分化、发育、转化及凋亡等.文章讨论了哺乳动物MAPK的功能和调节.     

致密斑细胞COX-2的表达及AP-1、NFκB信号通路

目的评估低盐(LS)培养对小鼠致密斑(MMDD1)细胞环氧化酶-2(COX-2)表达及核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)活性的影响。方法经脂质体转染含NF-κB或AP-1的报告质粒,采用瞬时表达方法检测正常盐(NS)与LS培养对NF-κB和AP-1转录活性的影响。采用RT-PCR检测MMDD1细胞COX-2表达的变化,Westernblot方法检测细胞内p-p38MAPK、p-p44/42、c-Jun、c-Fos和COX-2蛋白的表达。结果LS培养促进了MMDD1细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。LS培养后,p38和p44/42的磷酸化程度显著上调(P<0.01),180min后达到高峰。p38抑制剂SB-203580、p44/42抑制剂PD-98059可降低LS诱导的COX-2表达(P<0.01)。LS培养促进了c-Jun、c-Fos蛋白表达(P<0.01),激活了AP-1和NF-κB的转录活性(P<0.01)。25μmol/LNF-κB抑制剂PDTC和20μmol/LAP-1抑制剂curcumin下调了LS诱导的NF-κB、AP-1活性(P<0.01)。25μmol/LPDTC、20μmol/Lcurcumin降低了LS诱导的COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论LS培养可促进MMDD1细胞COX-2的表达,其作用可能与促进p38MAPK、p44/42激酶的磷酸化,增加NF-κB和AP-1的活性有关。     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的：探讨p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶（iNOS)基因的转录调控。方法：以人胚胎肾293（HEK293）细胞为靶细胞，采用脂质体（LPS）介导的细胞基因共转染技术，荧光素酶报告基因技术，分别将FLAG－tagged p38MAPK4种亚型，含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒（piNOS-Luc)，空载体（pcDNA3),β－半乳糖苷酶表面质粒（pCMV－β）共转染，检测并比较荧光素酶相对活性。结果（1）未加刺激时，在HEK293细胞中，p38MAPK中仅有p38α的诱导作用亦有明显，结论：（1）LPS能够在HEK293细胞中诱导iNOS基因转录活性；（2）在HEK293细胞中，p38MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iNOS基因的转录调控。     

C反应蛋白对NRK-52E细胞NF-κB信号传导与IL-6mRNA表达的影响

目的:探讨C反应蛋白(CRP)对肾小管上皮细胞NF-κB信号与IL-6 mRNA表达的影响。方法:体外培养的骨小管上皮细胞NRK-52E,分3组:①对照组:设阴性对照(加入PBS)和阳性对照(AngⅡ,1μmol/L);②CRP刺激组(分别加入CRP 5,10,20 mg/L);③干预组:加入10 mg/L CRP,同时加入CRP抗体1μmol/L或SB203580(10μmol/L,p38MAPK的特异性抑制剂)。分别应用ELISA、RT-PCR、Western Blot技术和EMSA方法,检测细胞p38MAPK的磷酸化、NF-κB活性与IL-6分泌与mRNA表达的变化。结果:CRP呈剂量依赖性上调NRK-52E细胞IL-6分泌与mRNA的表达。CRP上调NRK-52E细胞p38MAPK的磷酸化与NF-κB与DNA的结合活性。CRP抗体、SB203580下调CRP对NRK-52E细胞的炎性激活效应。结论:CRP直接诱导NRK-52E细胞NF-κB活化及下游因子IL-6 mRNA与蛋白质的高表达,可能通过p38MAPK的磷酸化途径。     

p38MAPK在脂多糖诱导的人内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶中的作用

目的：研究P38丝裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）在脂多糖（LPS）诱导的人内皮细胞－ECV304诱导一氧化氮合酶（iNOS)表达的一氧化氮（NO）产生中的作用，方法：用Griess法检测人内皮细胞培养液中NO水平，分别用免疫荧光法和RT－PCR检测细胞iNOS蛋白和mRNA的表达，采用免疫沉淀法检测细胞p38MAPK的活性，结果：与对照组相比，LPS刺激后的ECV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达显著增加，用p38特异性抑制剂SB2023580预处理后，可以显著抑制细胞iNOS的表达和NO的产生，LPS 刺激内皮细胞后15min,p38MAPK的活性达到高峰，维持45min后逐渐下降，结论：p38MAPK参与与LPS诱导的内皮细胞iNOS的表达和NO的产生，可通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生，为败血症休克的防治提供一条新的思路。     

骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究

  目的  探讨骨髓干细胞动员抑制大鼠心肌纤维化的机制与转化生长因子（TGF-β）介导的非经典通路的关系。  方法  22只Wistar大鼠通过皮下注射异丙肾上腺素（isoproterenol,Iso)建立心肌纤维化模型后,随机分为对照组（Con组）和动员组（GT组）,GT组大鼠皮下注射重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF),连续注射5 d,对照组同期皮下注射生理盐水。末次注射4周后,行HE和Masson染色观察两组大鼠心肌结构,ELISA法检测血清B型利钠肽（BNP）质量浓度,免疫组化染色观察心肌组织中Ⅲ型胶原表达,Western blot检测组织Ⅰ型胶原、TGF-β、转化生长因子激酶1( TAK1 )、丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的蛋白水平。  结果  与对照组相比,GT组大鼠血清BNP质量浓度降低(P<0.01);Masson染色胶原沉积减少,胶原面积比值下降(P<0.01);Western blot检测Ⅰ型胶原、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK表达较对照组均降低（P<0.05）。  结论  骨髓干细胞动员可改善大鼠心肌纤维化的程度,这种抗心肌纤维化的作用与抑制TGF-β/TAK1/MKK/p38MAPK通路有关。     

高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达及与p38 MAPK信号通路关系

目的:观察高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的作用及其与p38信号通路(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)的关系,从而进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制.方法:培养人RPE细胞,分为对照组、高糖组、高糖 SB203580组和甘露醇组,采用四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,免疫荧光染色法观察RPE细胞中磷酸化p38 MAPK和iNOS的蛋白表达.结果:①MTT检测结果:高糖可以抑制RPE细胞增殖,加入特异性p38 MAPK抑制剂SB203580预处理后,抑制作用减弱;②免疫荧光法检测结果:与对照组相比,高糖组磷酸化p38 MAPK,iNOS蛋白表达明显增高;加入SB203580预处理后,iNOS表达被显著抑制.结论:高糖能够抑制RPE细胞增殖,通过活化p38 MAPK信号通路刺激RPE细胞iNOS的表达,在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用.     

p38 MAPK在脂多糖诱导的人内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶中的作用

目的研究p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)在脂多糖(LPS)诱导的人内皮细胞－ECV304诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和一氧化氮(NO)产生中的作用。方法用Griess法检测人内皮细胞培养液中NO水平,分别用免疫荧光法和 RT－PCR检测细胞 iNOS蛋白和mRNA的表达,采用免疫沉淀法检测细胞 p38 MAPK的活性。结果 与对照组相比,LPS刺激后的BCV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达显著增加,用p38特异性抑制剂SB203580预处理后,可以显著抑制细胞 iNOS的表达和NO的产生。LPS刺激内皮细胞后15 min,p38 MAPK的活性达到高峰,维持45 min后逐渐下降。结论p38MAPK参与了LPS诱导的内皮细胞iNOS的表达和NO的产生;可通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生,为败血症休克的防治提供一条新的思路。