弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析

目的 表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性.结果 成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的＞30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础.     

细菌素PediocinPA-1融合蛋白的表达纯化

目的 在原核中表达和纯化融合蛋白.方法 IPTG诱导融合蛋白表达,表达的融合蛋白经金属镍离子螯合亲和层析纯化后,用分子筛Superdex G75进一步纯化和鉴定.结果 诱导表达后,通过SDS-PAGE分析,融合蛋白主要存在上清中,金属螯合层析和分子筛纯化后,所得融合蛋白的纯度大于90%.结论 获得纯化的融合蛋白,为进一步研究和应用奠定基础.     

肠出血型大肠埃希菌O104:H4转运蛋白AatA单克隆抗体制备及鉴定

目的 表达肠出血型大肠埃希菌O104 :H4的融合蛋白GST-AatA,获得单克隆抗体。方法 人工合成肠出血型大肠埃希菌O104 :H4的转运蛋白基因aatA,连接至pMDl8-T载体,转化E.coli DH5α,双酶切回收,构建原核表达质粒PGEX-6P-1-GST-AatA,测序鉴定后,转化E.Coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot分析目的蛋白的表达并纯化该重组蛋白。将纯化后的融合蛋白GST-AatA免疫Balb/c小鼠,制备相应单克隆抗体;并对该单克隆抗体的纯度、亚型、效价、特异性进行鉴定和分析。结果 构建的原核表达载体PGEX-6P-1-GST-AatA能表达融合蛋白GST-AatA;亲和层析纯化后融合蛋白GST-AatA纯度达到95 %,免疫小鼠后得到相应特异性单克隆抗体。结论 成功制备出一株抗转运蛋白AatA的单克隆抗体,该抗体为IgG1亚型,特异性好,效价高,纯度可达97%。     

SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的原核和真核表达

目的:在大肠杆菌中表达和纯化重组RDRP蛋白,观察RDRP蛋白在293细胞中的表达及亚细胞定位.方法:构建原核表达质粒pGEX-4T-1-RDRP,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.构建真核表达载体pCMV-myc-RDRP瞬时转染293细胞,转染48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位以及Western Blotting检测.结果:成功构建了表达RDRP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到分子量约为121 kDa的融合蛋白.RDRP蛋白在293细胞中高效表达,主要分布在细胞质.结论:获得了重组GST-RDRP融合蛋白,为进一步探讨RDRP的功能奠定基础,在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质.     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

人源性DNA聚合酶β原核蛋白的表达、蛋白纯化及其功能初探

[目的]利用人源性DNA聚合酶β原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化DNA聚合酶β蛋白,并检测蛋白活性。[方法]将重组质粒pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ转化入大肠杆菌E.coli中,IPTG诱导其表达并鉴定。利用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到人源性DNApolβ融合蛋白,纯化的融合蛋白用EK酶酶切后,通过Ni2+柱纯化获得高纯度的人源性DNApolβ蛋白,电泳迁移率变动分析实验检测DNApolβ融合蛋白的AP修复活性。[结果]转化入大肠杆菌E.coliRosetta2的DNApolβ诱导表达最好,蛋白表达量高。金属螯合层析纯化后得到融合蛋白经EK酶切后得到高纯度的人源性DNApolβ蛋白,EMSA实验证明所纯化的DNApolβ融合蛋白不具有AP修复活性。[结论]利用原核表达载体pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ在E.coliRosetta2中表达和纯化获得高纯度的DNApolβ融合蛋白,为下一步开展DNApolβ蛋白的生物学功能研究打下基础。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

细菌素PediocinPA-1融合蛋白的表达纯化

目的在原核中表达和纯化融合蛋白。方法 IPTG诱导融合蛋白表达,表达的融合蛋白经金属镍离子螯合亲和层析纯化后,用分子筛Superdex G75进一步纯化和鉴定。结果诱导表达后,通过SDS-PAGE分析,融合蛋白主要存在上清中,金属螯合层析和分子筛纯化后,所得融合蛋白的纯度大于90%。结论获得纯化的融合蛋白,为进一步研究和应用奠定基础。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原基因在大肠杆菌中的表达

采用 PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株 (PFD- 3/ YN)丝氨酸重复抗原基因片段 ,经基因序列测定后克隆于 p GEX- 4T- 1融合蛋白表达载体 ,并转化大肠杆菌 TG1。SERA基因与 p GEX- 4T- 1重组后能在大肠杆菌 TG1中表达一 45 KDa的融合蛋白 ,当工程菌 OD5 90 为 0 .8～ 1.0时 ,加入终浓度 1m mol/ L IPTG进行诱导 ,表达量较高。采用 dot- EL ISA对表达产物进行鉴定。结果表明 SERA融合蛋白能被抗 SERA单克隆抗体所识别。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

家蝇幼虫抗菌肽diptericin2基因的克隆及原核表达-鉴定

目的扩增出全长diptericin2基因,并构建表达pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白。方法运用经典的5′末端扩增法(5′-Full RACE)法,通过双酶切、连接反应,将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析diptericin2重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹实验(Western-blotting)对其进行了鉴定。结果获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因(GENBANK登录号FJ795370),双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27 kDa。结论扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白原核表达系统,融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达,为下一步研究其生物活性打下初步的基础。     

HSV-1重组糖蛋白G的表达、纯化及活性鉴定

目的对构建的pGEX-4T-1/gG-1重组质粒进行诱导表达,并纯化、鉴定表达的目的蛋白。方法用最佳诱导条件对重组质粒进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心后上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gG-1融合蛋白进行灵敏性和特异性等生物活性的初步鉴定。结果目的蛋白经诱导后表达于上清中,初步鉴定纯化的目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性。结论 GST/gG-1融合蛋白的获得,为研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型HSV-1型特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础。     

小鼠截短型CDC25B蛋白PKA体外磷酸化分析

目的通过体外磷酸化研究和放射自显影技术证实小鼠CDC25B蛋白是蛋白激酶A(PKA)的直接作用底物。方法构建小鼠截短型pGEX-4T-2-CDC25B201原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化CDC25B蛋白,与PKA进行体外磷酸化反应,分别采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印迹(western blot)和放射自显影鉴定CDC25B是否为PKA直接磷酸化底物。结果在E.coli BL21细胞内,采用0.1 mmol/L的IPTG在27℃条件下诱导表达3 h即可达到较高表达水平;SDS-PAGE显示在约50 kD处有明显GST-CDC25B201融合蛋白特异条带;放射自显影显示GST-CDC25B201融合蛋白的磷酸化条带大约位于55 kD处;Western blot分析,在重组质粒表达的总蛋白、载体表达的GST蛋白、纯化蛋白及磷酸化蛋白的相应位置均出现GST抗体的杂交条带。结论小鼠CDC25B蛋白是PKA的直接作用底物。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的表达、纯化及鉴定

目的 对pGEX-4T- 1/gG-2重组质粒进行诱导表达,并纯化、鉴定表达的目的蛋白.方法 用最佳诱导条件对重组质粒进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gG-2融合蛋白的灵敏性和特异性等生物活性进行鉴定.结果 目的蛋白经诱导后表达于上清中,经鉴定纯化的目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性.结论 GST/gG-2融合蛋白的获得,为研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型HSV-2型特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

Attacin抗菌肽基因体内抗菌活性研究

目的建立Attacin基因体内抗菌活性检测系统,并初步研究其抗菌活性。方法PCR扩增Attacin编码区目的序列,并构建原核表达重组质粒,转化大肠埃希菌,在体内检测Attacin的抗菌活性,同时SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果与未诱导对照相比,包含重组质粒的宿主菌生长受到抑制,含pET30a（＋）/Attacin宿主菌诱导表达后,提纯不到His-Attacin融合蛋白,而含pGEX-4T-1/Attacin宿主菌可获得GST-Attacin融合蛋白。结论建立灵敏、简便的Attacin体内抗菌活性检测方法,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定基础。     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。