人脐动脉平滑肌细胞体外培养的生物学特性及其永生株的初步建立

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞（HUASMC）原代．传代培养的最佳方法，并初步建立其永生株。方法 采用人脐动脉血管中膜组织块贴壁法原代培养，比较不同培养养基对原代及传代细胞增殖的影响；选择标记为新霉素（G418）的带有端粒酶催化亚基（hTERT)基因的重组质粒导入人脐动脉血管平滑肌细胞。结果 经α肌动蛋白鉴定，组织块贴壁洒可获得高纯度的HUASMC。原代培养的HUASMC1－4代细胞增殖能力强，生长旺盛，此后细胞的增殖逐渐降低，到第10代几乎丧失增殖力。原代培养以MCDB131为最佳培养基。hTERT转染细胞克隆由长梭形变为短梭形，接触抑制消失，生长速度快，目前已传至20代，增殖能力与第1代无差别。转染前后平滑肌特异的α－肌动蛋白表达阳性。结论 hTERT转染的HUASMC保留了HUASMC的基本生物学特征，能保持较强的增殖能力持续传代。     

大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养优化与鉴定研究

目的:为提高大鼠胃窦平滑肌细胞(GASMC)原代培养成活率,对原代培养大鼠胃窦平滑肌细胞方法进行创新与优化,以增强胃窦平滑肌细胞原代培养方法实用性、可操作性。方法:绝对严格无菌环境取大鼠胃窦组织,剥离胃粘膜层及浆膜层,应用优化法原代培养、0.25%胰酶消化传代培养、苏木素染色法细胞形态观察、免疫组化法细胞鉴定。结果:应用优化大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养法2～4天组织块周围有长梭形细胞爬出,5～8天爬出细胞放射状或网状生长,9～11天有明显"峰-谷"样结构,且相互融合。传代细胞生长速度快,呈大片融合,细胞体积增大。免疫组化染色鉴定表达阳性的细胞93%以上。结论:应用优化的大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养方法,细胞生长快、成活度高、操作简便易行,具有创新性,实用性强,值得推广。     

人脐带动脉平滑肌细胞的培养及纯化

目的探讨血管平滑肌细胞培养和纯化的方法。方法用胎儿脐带动脉为材料,植块法原代培养人脐带动脉平滑肌细胞,传代过程中差异贴壁法纯化,相差显微镜观察培养细胞的形态,免疫组化染色检测细胞胞浆内α-肌动蛋白(α-actin)的表达。结果相差显微镜下观察细胞呈长梭形,生长致密时排列成相互平行的束状,未见明显异型细胞,α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的99%以上。结论用胎儿脐带动脉为材料进行血管平滑肌细胞原代培养,传代过程中同时纯化的方法,简便可靠。     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法.方法 运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养.倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定.结果 原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征.经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞.结论 植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础.     

动脉平滑肌细胞体外培养模型及生长特点

目的 探讨胎儿动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞体外培养方法,明确不同平滑肌细胞的原代和传代后生长情况。方法 采用改良贴壁法一玻片压迫组织贴壁方法进行胎儿动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞的原代培养,并将细胞进行传代后培养,同时对各细胞的生长进行观察。结果 ①采用改良贴壁法可使原代细胞良好生长,动脉导管的平滑肌细胞无论是从组织块游出时间还是生长呈“峰一谷”样时间和细胞首次传代时间都比肺动脉和主动脉的要长;②在细胞的继代培养期,动脉导管平滑肌的生长周期长于主动脉,主动脉的平滑肌生长周期长于肺动脉。结论 动脉导管、主动脉及肺动脉平滑肌细胞体外生长存在差异。     

组织块贴壁法原代培养人脐血管平滑肌细胞的改良

目的提高人脐血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)体外培养的成功率。方法以传统的平滑肌细胞贴壁培养法为基础,选择人脐血管为材料,对培养基配置,组织块的大小和接种间距,培养液的pH等多个重要环节进行改进;采用倒置相差显微镜和α-actin免疫组化染色,对VSMCs进行鉴定。结果光镜下见培养细胞呈典型的"峰、谷"样结构特征;α-actin免疫组化染色显示98%的细胞含有肌动蛋白,证实为VSMCs。结论此培养方法能提高人脐血管平滑肌细胞体外培养的成功率,为心血管疾病发病机制的体外研究,提供了一种实用而充足的细胞材料。     

成人主动脉血管平滑肌细胞的体外培养

目的:建立成人主动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法:方法:无菌条件下分离出成人胸主动脉的平滑肌层,剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎片,用组织块贴壁法,以含胎牛血清的DMEM培养基进行培养,牛长融合的细胞用0.25%的胰酶消化、传代。观察培养细胞的形态学特点,并用免疫荧光的方法检测血管平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的表达。结果:在贴壁培养10～12天后,组织块的边缘开始有少量细胞爬出,呈长梭形,胞浆透亮、丰富:继续培养1～2周后组织块边缘融合,呈典型的"峰谷"样表现。消化传至3～8代,细胞的生长特性未见明显改变,免疫荧光显示细胞α-SMA的表达丰富。结论:组织块贴壁法培养人主动脉血管平滑肌细胞是一种稳定、可行的实验方法。     

组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的探讨以原代培养的方法获得活力稳定、高度纯化的大鼠血管平滑肌细胞的体外模型,并为相关研究提供所需的试验材料。方法采用组织贴块法进行细胞原代培养,胰酶消化传代,液氮冻存,并应用倒置相差显微镜和SP法免疫组化染色对细胞进行鉴定。结果85％的组织块接种存活,传代后90％以上的平滑肌细胞重新贴壁生长,冻存后细胞再行1～2次传代后可恢复增生活力。显微镜下细胞呈典型的“谷峰状”生长,SP法免疫组化染色显示胞质内“平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论组织块贴壁法简便易行,短期内可获大量符合后续试验要求的血管平滑肌细胞。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

糜酶对人血管平滑肌细胞增殖血管紧张素Ⅱ生成及细胞增殖的影响

目的 探讨阻断糜酶途径对人血管平滑肌细胞血管紧张素（Ang）Ⅱ生成及细胞增殖的影响。方法通过植块培养法获得人脐动脉血管平滑肌细胞,设立5组培养液并分组：对照组,AngⅠ组,卡托普利组,糜酶抑素组,缬沙坦组。对照组中仅为空白DMEM培养液,其他各组均加入AngⅠ（浓度均为10^-8mol／L）,此外卡托普利组、糜酶抑素组、缬沙坦组分别加入相应的干预药物（浓度均为10^-4mol／L）。作相应时间培养后测定各组细胞计数、细胞增殖指数及培养液中AngⅡ含量。结果本实验成功培养出人血管平滑肌细胞,免疫组化染色示阳性细胞达95％以上。卡托普利组、糜酶抑素组及缬沙坦组细胞计数[（624±024）、（5．39±0．51）、（5．26±0．67）个]及刺激指数（1273±0．121、1175±0.098、1．128±0.038）均显著低于AngⅠ组[（7.43±0．33）个、1．424±0．168]（均P〈0．01）,而且糜酶抑素组较卡托普利组更低（P〈0．01）,与缬沙坦组相当;糜酶抑素组AngⅡ含量[（59．0±75）pg／ml]较AngⅠ组、卡托普利组及缬沙坦组[（150．0±302）、（169．0±205）、（2200±29．0）pg／ml]更低（均P〈0.01）,而缬沙坦组则显著高于其他所有组（P〈0.01）。结论糜酶在血管平滑肌细胞AngⅡ生成及细胞增殖过程中起着重要作用。     

用细胞培养法组建动脉壁及电镜观察

在体外用细胞培养的方法,将人脐带静脉内皮细胞种植在已培养成复层的人脐带动脉平滑肌细胞上面,人工组建成动脉壁结构。在营养液中含内皮细胞生长因子及维生素C条件下,两种细胞生长良好,构成活的具有代谢过程及增殖力的血管壁。光镜及电镜下观察,两种细胞组成典型的血管壁的结构层次,在内皮细胞与平滑肌细胞之间,在平滑肌细胞与平滑肌细胞之间,充填有大量胶原纤维、网状纤维与少量的弹力纤维,并发现这些纤维结构物质是由血管平滑肌细胞产生的。为研究血管壁的生理与病理过程提供了良好的血管壁模型。     

无或低血清条件下高压培养促进平滑肌细胞和内皮细胞生长

目的观察高压培养对无或低血清条件下平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法用无或0.5%血清培养基,在高于1个标准大气压（标准大气压设定为0 mmHg）30-180 mmHg压力下培养人脐静脉内皮细胞和大鼠血管平滑肌细胞。用台盼蓝染色细胞计数法和MTT评价细胞的生长情况。结果在低血清条件下,高压培养的血管内皮细胞生长速度明显快于标准大气压培养的血管内皮细胞,细胞计数和MTT结果显示高压培养比大气压培养细胞生长增加约30%。无血清大气压培养平滑肌细胞2天后,未见明显的活细胞,而高压培养大鼠平滑肌细胞仍能保持生长。结论无或低血清条件下,高压培养能保持血管平滑肌和血管内皮细胞的生长。     

接种密度对人脐静脉间充质干细胞原代培养的影响

目的:探讨不同接种密度对人脐静脉间充质干细胞(hUV-MSCs)原代培养的影响,从而确定原代培养hUV-MSCs的适宜条件。方法:分离人脐静脉内皮及内皮下层细胞,按不同接种密度分组进行原代培养,记录原代培养时间,然后进行传代和成骨诱导培养,并检测细胞钙结节的表达情况。结果:hUV-MSCs原代分离培养消化30min,种植细胞密度为5×105~1×106/cm2的方法较合理。经化学药物(如地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C)成骨诱导后,可形成钙结节。结论:合理hUV-MSCs原代培养方法,可以快速获得最大量的自体种子细胞,从而为组织工程化骨的体外构建创造条件。     

在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的实验研究

目的探索在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的可行性。方法将新型可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）做成多孔状PHB＋胶原包埋管形支架。采用酶消化法和组织块法分别培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞和人成纤维细胞的混合细胞悬液接种于胶原包埋的PHB内腔面,采用动态旋转系统下培养3周,行大体观察和扫描电镜观察。结果在动态旋转系统中构建的小口径组织工程化血管,在细胞结构上形成均匀血管组织。结论在动态旋转系统下构建组织工程化血管是可行的,为下一步行混合种植后行组织工程化血管移植试验打下基础。     

血管平滑肌细胞和内皮细胞联合种植生物可降解材料的组织工程血管研究

目的探讨应用组织工程学方法构建人工血管片。方法应用聚(乙交酯/丙交酯)二元共聚物(PLGA)无纺网织片作为细胞支架,体外逐层顺序种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作组织血管片。免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞、内皮细胞;扫描电镜观察组织血管片生长情况;放射免疫方法检测内皮细胞分泌内皮素、前列腺素E的功能。结果免疫组织化学染色鉴定平滑肌细胞肌动蛋白染色阳性,内皮细胞凝血Ⅷ因子相关抗原染色阳性。组织血管片在扫描电镜下显示出细胞融合,连接成片。放射免疫方法可以检测出平滑肌细胞和内皮细胞联合培养的组织片分泌内皮素(229pg/ml±34pg/ml),分泌前列环素的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(402pg/ml±108pg/ml)。结论应用PLGA无纺网织片作为细胞支架,体外逐层种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作的组织血管片,基本具备正常血管组织基本形态结构和功能。     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

新型katp开放剂埃他卡林对原代培养人肺动脉平滑肌细胞pcna mrna表达的影响

目的:观察新型ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂埃他卡林(IPT)对原代培养人肺动脉平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA表达的影响。方法:分离3～4级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,分成对照组、缺氧组、缺氧+埃他卡林或吡那地尔组及缺氧+埃他卡林或吡那地尔+格列本脲组,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)技术检测细胞PCNA mRNA表达。结果:缺氧使人肺动脉平滑肌细胞PCNA mRNA表达增加(3.90±0.24)倍,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);相同条件下,在缺氧的同时,分别在培养液中加入IPT 10-7、10-6、10-5 mol/L,PCNA mRNA表达分别下降(26.00±2.01)%、(55.33±4.04)%、(79.00±1.00)%,与缺氧组比较差异均有显著性(P均<0.01);加入IPT 10-5mol/L前30 min,预先加入格列本脲(GLI)10-5 mol/L,IPT的抑制作用抵消,与缺氧+IPT 10-5 mol/L组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:IPT通过激活细胞KATP通道,浓度依赖性地抑制缺氧时原代培...     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的：摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法：采用0．25％胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,含20％FBSDMEM养基培养,待细胞80％融合后,以O．25％胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果：原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3－5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论：用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。