直接贴壁法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞

摘要：目的利用直接贴壁法体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,并检测其分化效率。方法人胚胎干细胞以1×10’个／cm2的细胞密度传代到铺备有基质胶的培养皿中培养,用带8ng／ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的条件培养基培养6d后,更换为RPMI1640．B27培养基,同时加入100ng／ml的人重组activinA处理24h,接着再加入10ng／ml的人重组骨形态发生蛋白4（BMP4）处理4d,之后更换为不带诱导因子的RPMI1640．B27培养基,每隔2～3d换1次培养基,持续2～3周。在光学显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT）;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化13d左右开始出现。分化出现自发跳动心肌细胞的时间为（13．0±1．1）d,百分比为66．7％,跳动频率为（63．0±7．0）次／分;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h后检测到凋亡比率为8．0％±0．5％。结论国内首次利用直接贴壁法在体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到66．7％,分化时间13d左右。     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向内皮细胞分化的条件,为组织工程血管提供种子细胞。方法取怀孕12.5d的昆明小白鼠1只,断颈处死,取其胚胎,培养制备小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)。常规复苏ESC后进行体外培养,采用悬滴-悬浮法制备拟胚体(embryoid body,EB)。将EB分两组:实验组加入含有3ng/ml转化生长因子β1、50ng/ml血管内皮细胞生长因子及1μmol/L激活素受体样激酶选择性抑制剂的EB培养基;对照组只加入EB培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用RT-PCR及免疫组织化学染色检测诱导细胞vWF和CD34的表达,验证细胞性质。结果原代MEF生长迅速,第3天细胞融合达90%左右,细胞呈长梭形,有少量侧支,细胞核饱满,有2~3个核仁,细胞排列紧密。传至3~5代,细胞呈多角形,胞浆饱满,有3~4个核仁,细胞表面分泌较多细胞颗粒。ESC在饲养层上保持未分化状态,细胞团形态呈鸟巢样,边缘平整,单个细胞体积小,折光性强,核质比高,增长速度快。悬滴培养3d的EB肉眼可见,再经悬浮培养3d后,形成较大的透亮EB;EB贴壁后第2天,球体略摊开。实验组第4~7天,EB周围有许多圆形细胞产生,第10~14天,可见由大量圆形细胞组成的血管样结构自EB周围生长;对照组EB周围未见血管样结构生长。免疫组织化学染色见EB周围大量vWF染色阳性细胞,RT-PCR检测到vWF和CD34的表达。结论ESC在特定的条件下可以分化为内皮细胞,有可能为组织工程血管提供大量的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MsCs)定向分化为心肌细胞的可行性，建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MsCs；用5-氮杂胞苷(0．1、1、5、10、50和100μmol/L)定向诱导24h，分别在诱导培养的第14d和21d，检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs，移植于急性梗死心肌组织内，4周后进行组织学和免疫组织化学染色，并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导，培养21d后，5和10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白，并一些细胞自发性跳动；细胞移植4周后，在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。结论MsCs可以分化成心肌细胞。     

胚胎干细胞体外诱导分化为黑色素细胞的研究进展

胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESs）是从早期胚胎内细胞团（Inner cell mass,ICM）或桑椹胚中分离出的高度未分化的全能细胞。ES细胞体外诱导分化为黑色素细胞的过程能更明确皮肤黑色素细胞和视网膜黑色素上皮细胞（Retinal pigmented epithelium,RPE）的基因选择性表达程序。     

核移植胚胎干细胞的鉴定及诱导分化研究

目的 观察胚胎后肾细胞微环境诱导核移植胚胎干细胞( ntESCs)分化为肾系细胞的作用.方法 分离小鼠ntESCs样集落,对ntESCs进行鉴定.将核移植拟胚体(ntEBs)与胚胎后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测诱导后ntEBs与对照组中肾组织Wilms瘤抑癌因子1(WT-1)、Wnt-4、同源盒基因2(pax-2)、c-Ret、足细胞标记蛋白( podocalyxin)和Nephrin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测诱导后ntEBs与对照组的Pax-2、WT-1蛋白表达.结果 mESCs集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.ntEBs共培养组WT-1、Wnt-4、pax-2、c-Ret、podocalyxin和Nephrin均有表达,而对照组则为阴性;免疫荧光结果显示ntEBs细胞诱导分化后Pax-2荧光强度为(++);而实验组WT-1荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论 后肾细胞微环境可促进核移植胚胎来源ntESCs分化为肾系细胞.     

诱导人孤雌胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的实验研究

目的探索人孤雌胚胎干细胞在体外向类间充质干细胞诱导分化的方法 ,并鉴定所得细胞的生物学特性。方法人孤雌胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养,形成拟胚体,10d后在含血清条件下使拟胚体贴壁生长,7d后胰酶消化,所得细胞在含血清的培养液中传代、扩增。观察传代、扩增后细胞的形态学变化;用免疫荧光染色和流式细胞技术进行细胞表型分析;取第9代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,9～28d后行特殊染色及RT-PCR分析。结果人孤雌胚胎干细胞在诱导分化后,形态与骨髓间充质干细胞相似,多次扩增传代后仍保持细胞形态和扩增能力。免疫荧光染色发现,细胞表达中胚层标志波形蛋白(Vimentin)。流式细胞分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166、CD44等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCR分析显示:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶和茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后,细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强;成脂诱导后,细胞油红染色阴性,脂蛋白酶和Leptin无表达。结论人孤雌胚胎干细胞可以诱导、分化为间充质干细胞,并具有成骨、成软骨分化潜能。     

鼠胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞

目的 采用简单贴壁培养方法诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为内皮样细胞,为组织工程血管及细胞替代治疗提供新的种子细胞.方法 小鼠ESC株SV129按2×104个/cm2密度传代培养,采用ESC培养基添加1 000 U/mL白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)维持其未分化状态.撤除LIF,ESC悬浮培养形成拟胚体(embryoid body,EB),将培养第4天的EB置于含VEGF的培养基中贴壁培养,诱导分化.采用免疫组织化学染色、流式细胞仪分析、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeledacetylated low density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)摄取实验以及透射电镜检查鉴定分化细胞的性质.结果 分化产生的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,能摄取DiI-Ac-LDL.ESC诱导分化培养产生的第15代细胞免疫组织化学染色呈Flk-1和CD31阳性;流式细胞仪检测ESC传至9代后CD31阳性细胞>90%;透射电镜可见怀布尔-帕拉德体及内皮细胞间紧密连接.结论 采用简单贴壁培养的方法,单独使用VEGF即可诱导ESC分化为内皮样细胞.诱导培养方法操作简便,经济实用,可为组织工程血管及细胞替代治疗提供所需内皮样细胞.     

毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外诱导人毛囊干细胞成血管内皮细胞的可行性。方法采用中性蛋白酶(Dispase)分离人毛囊干细胞,用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2诱导液对其诱导,以无诱导因子的基础培养液为对照组,对每代细胞形态进行观察。诱导4代后,检测vWF(von Willebrand factor)与CD31的表达。结果在诱导液的作用下,细胞形态逐步向内皮细胞的铺路石样形态转变,对照组细胞形态改变不明显。至第4代,实验组已明显表达vWF与CD31,对照组表达不明显;流式细胞仪检测显示,实验组阳性表达率近80%,对照组则低于5%;RT-PCR显示,实验组表达vWF,对照组未见明显表达。结论使用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2诱导液,可在体外诱导人毛囊干细胞分化成血管内皮细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

胚胎干细胞体外分化为成骨细胞研究进展

目的 对胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）体外诱导分化为成骨细胞的研究现状、诱导分化中存在的问题，以及进一步的研究方向作一综述。方法广泛查阅近年来关于ESCs体外诱导分化为成骨细胞的文献，并进行总结与分析。结果ESCs可以作为理想的成骨细胞种子细胞来源。结论诱导ESCs定向分化得到骨组织工程种子细胞——成骨细胞有巨大的应用潜力，不仅提供了分析成骨细胞发生的分子机制模型，而且奠定了其在骨组织修复中的基础。     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

脂肪源性干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

脂肪源性干细胞因具有生物学特性稳定、来源广泛、取材方便、数量充足、易于培养扩增的优点,且在特定的诱导条件下可以分化为心肌细胞,有望成为细胞治疗的理想来源。诱导方法的选择,影响分化因素的研究已成为了细胞治疗领域研究的热点。本文就脂肪源性干细胞向心肌细胞诱导分化的方法和机制的研究进展进行综述。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

小鼠胚胎成纤维细胞滋养层对小鼠诱导多能干细胞的作用研究

目的:探讨小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)滋养层对小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)适宜的培养条件及其作用机制。方法:取E12.5~14.5d ICR孕鼠,培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),制备滋养层,收集第2~3代(P2~P3)和第6代(P6)培养2~4d MEFs滋养层细胞培养基(MEF-CM),ELISA检测P2~P3和P6 MEF-CM中Activin A、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的浓度水平。i PSCs与滋养层细胞共同培养,并进行细胞鉴定。结果:ELISA检测结果显示P2~P3 MEF-CM中Activin A、LIF的浓度显著高于P6 MEF-CM,差异有显著性意义(P0.05)。i PSCs呈克隆状生长,细胞鉴定结果显示:拟胚体形成;碱性磷酸酶染色呈阳性;0CT4表达阳性。结论:E12.5~14.5d来源的P2~P3 MEFs滋养层能有效的抑制i PSCs的分裂,支持i PSCs的生长并维持其全能性。     

胚胎干细胞分化为软骨细胞的研究现状与展望

胚胎干细胞具有多向分化潜能,在组织修复治疗方面具有广阔的应用前景.近年研究表明,胚胎干细胞在细胞因子、激素、微环境等作用下能够分化为软骨细胞.本文对近年来胚胎干细胞向软骨细胞定向分化中的各种因素进行综述.     

羊膜和结膜基质诱导胚胎干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的观察小鼠胚胎干细胞在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。方法36只新西兰兔随机分为3组，每组12只。A组：将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的小鼠ES-GFP细胞用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后行实验兔结膜下移植；B组：将小鼠ES—GFP细胞接种到人羊膜上共培养4d，用BrdU标记后移植到实验兔结膜缺损区；C组：采用保存羊膜移植到实验兔兔结膜缺损区。分别于移植后1、2、3、4，6和8周，摘取各组实验眼行荧光显微镜、组织学和免疫组织化学检查，荧光检测ES-GFP细胞在组织中的荧光表达，组织学检查移植到结膜基质的ES-GFP细胞的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的ES．GFP细胞CK3／CK12和CK13的表达。结果小鼠ES-GFP细胞接种到人羊膜后能在羊膜上贴附生长，与羊膜共培养4d后部分ES-GFP细胞分化为多角形上皮样细胞，免疫组化显示β1整合素阳性。将负载有ES—GFP细胞的羊膜移植到兔结膜缺损区，术后荧光显微镜可在结膜上皮层检测到绿色荧光带，免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。结论采用保存人羊膜负载小鼠ES细胞行兔结膜移植，小鼠ES细胞能在兔结膜基质存活并增殖。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的研究体外三维培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化软骨细胞可行性。方法用密度梯度离心法分离纯化BMSCs,并传代扩增后,用离心三维培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养,以常规培养液培养的BMSCs作为阴性对照,于诱导培养第21天取出标本行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、s-100蛋白免疫组织化学检测。结果BMSCs经21d的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织切片甲苯胺蓝染色呈明显异染,s-100蛋白免疫细胞化学检测阳性。对照组阴性。结论成人BMSCs在三维培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的初步实验研究

目的:探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性.方法:抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离纯化MSCs,培养扩增后,用含EGF不同介质诱导,观察细胞形态的变化,免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达.结果:免疫组织化学染色显示EGF诱导后3dMSCs角蛋白表达较弱,7d角蛋白表达增强.流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少,7d表达角蛋白的细胞数量明显增加.结论:MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞.