川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:探讨川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞(ES)分化为心肌细胞的特征,建立简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系。方法:观察川芎含药血清作用下ES细胞活性,诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现,第5天达到高峰,约有70%的拟胚体产生跳动。用RT-PCR法在跳动的拟胚体中检测心肌细胞特异性标志物β-MHC的表达。结果:川芎含药血清培养下的细胞β-MHC的表达水平和分化率均明显升高,与大鼠血清组和胎牛血清组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:川芎含药血清可明显提高体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的效率。     

诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :分别使用布法罗大鼠肝细胞 (buffaloratsliver,BRL)条件培养基或鼠胚成纤维细胞 (mouseembry onicfibroblast,MEF)饲养层体外培养 ,比较不同培养条件对胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ESC)分化为心肌细胞的影响。方法 :用BRL条件培养基或MEF饲养层抑制ESC分化并保持其增殖 ,以维甲酸 (retinoicacid ,RA)、二甲基亚砜 (DMSO)、转化生长因子 β1(TGF β1)、激活素 A(activin A)为分化诱导剂 ,组合成 6种分化培养基 ,采用悬滴、悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞 ,比较各组分化比率。结果 :BRL及MEF饲养层两种条件均能促进ESC增殖 ,6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞 ;其中以BRL条件培养基培养 ,TGF β1(2ng·ml-1)、activin A(2 0ng·ml-1)及 2 0 %胎牛血清 (fetuscalfserium ,FCS)组成的分化培养基可以使 (92 .8± 2 .2 ) %的ESC分化为心肌细胞 ,分化比率显著高于其它各组 (P <0 .0 1)。结论 :以BRL条件培养基培养 ,TGF β1、activin A细胞因子组合是一种理想的ESC体外分化体系。     

小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

目的：探索提高胚胎干细胞（ESC）体外诱导分化为心肌细胞的实验方法.方法：采用悬滴—悬浮—贴壁三步法（悬滴三步法）和悬浮—贴壁两步法（悬浮两步法）,按诱导剂的不同分为Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷（5-aza）组;Ⅱ组：丹参＋维甲酸（RA）组;Ⅲ组：5-aza组;Ⅳ组：丹参组;Ⅴ组：RA组;Ⅵ组：阴性对照组6组进行诱导培养,比较在2种培养方法下各组心肌细胞的分化率.结果：Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组采用悬滴三步法培养的心肌细胞分化率分别为（77.78±5.09）%,（66.67±8.82）%,（51.11±1.92）%,（44.44±5.09）%,（23.33±3.34）%;采用悬浮两步法培养的心肌细胞分化率分别为（42.22±6.94）%,（36.67±8.82）%,（25.55±10.71）%,（17.78±5.09）%,（10.00±2.84）%.各组心肌细胞分化率悬滴三步法较悬浮两步法高,差异具有统计学意义（P〈0.05）.采用悬滴三步法培养Ⅰ组心肌细胞分化率最高可达78%,与其它各组相比较差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论：悬滴三步法联合采用中药丹参与5-aza为诱导剂,可为体外ESC分化为心肌细胞的实验方法提供理论依据.     

抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞

目的探讨采用抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,mESC）分化为心肌细胞的可行性。方法未分化ES细胞在滋养层上长至汇合,胰酶消化成单个细胞经旋转生物反应器（RCCS）制备拟胚体（em-bryoid bodies,EBs）,EBs贴壁后用抗坏血酸诱导分化为心肌细胞。通过光镜观察跳动的心肌细胞,采用免疫组织化学、激光共聚焦显微镜（CLSM）和RT—PCR的方法鉴定心肌细胞。结果抗坏血酸能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化,诱导效率为90％;分化的心肌细胞自发而有节律地收缩,心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-辅肌动蛋白（α—actinin）、肌动蛋白（actin）表达阳性。此外,分化的心肌细胞还表达调控心肌发育的基因α—MHC、β—MHC。结论抗坏血酸能有效地诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞。     

小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

1981年，英国Evans等首先报道了由小鼠囊胚内细胞群经体外培养而成功获得胚胎性干细胞(embryonic stem cells，ES)。同年，美国Martine。建立了小鼠ES细胞系，由于ES细胞具有分化的全能性，在体外培养过程中加入合适的诱导分化剂可以诱导出所需要的特殊类型细胞和组织，从而引起了人们的极大关注。ES细胞向心肌细胞定向分化的研究将为临床心肌损害的治疗提供一条新的思路。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。     

药物介导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞

胚胎干细胞 ( embryonic stem cells,ES细胞 )具有体外不分化的无限增殖能力 ,当处于合适的培养条件下 ,可定向分化形成多种单一的细胞。本研究利用 ES细胞的这种特性 ,以小鼠ES细胞作为生物测试载体 ,采用特定的药物改变其培养微环境 ,经过约 1 3 d培养 ,先后分两批定向分化出 3 0多个具有自律性搏动的心肌细胞团。其搏动频率有差异 ,范围在 80～ 1 3 0次/min之间 ,各细胞团搏动的节律非常有规则 ,以搏动频率与节律作为评价指标 ,定向分化成功率达 80 %以上。开展上述研究 ,旨在构建一种可提供生物信息量大而专一性强的体外药物筛选模型…     

淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究

目的 采用药物淫羊藿苷(icariin,ICA)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养的微环境,建立一种药物介导提高ES细胞体外定向心肌细胞分化率的实验体系.方法 采用悬滴培养法,构建ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的实验评价体系;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定心肌细胞.结果 ICA在10-7mol&#183;L-1浓度时,对ES细胞定向分化为心肌细胞呈现最佳诱导效应,分化率最高达84%(P＜0.001).ES细胞源心肌细胞表达心肌特异性基因肌球蛋白重链(α-MHC)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v),且心肌特异性肌小节α辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白T(troponin T)呈阳性表达.结论 悬滴培养法结合药物改善微环境,可用于药物诱导ES细胞定向分化心肌细胞的实验体系.     

小鼠胚胎干细胞体外分化为肝细胞的实验研究

[目的]探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为肝细胞的条件,为肝细胞移植寻找新的细胞来源.[方法]采用半固体培养D3胚胎干细胞系,形成胚胎体,加入或不加入细胞因子,在不同的时间点采用PCR方法对肝细胞的特异性蛋白甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)进行检测.[结果]小鼠胚胎干细胞在小鼠白血病抑制因子(LIF)存在的情况下保持未分化生长状态,不表达肝细胞的特异性基因AFP和ALB,撤去LIF后在半固体培养基中很快发育为胚胎体并继续分化.分化8 d的胚胎体可以检测到AFP mRNA的表达,且其在8～18 d的胚胎体中表达逐渐增加.16 d的胚胎体开始检测到ALB mRNA的表达,它也表达在18 d的胚胎体,成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和神经生长因子(NGF)对胚胎干细胞向肝细胞分化在此培养体系中没有作用.[结论]胚胎干细胞经过胚胎体发育阶段,可分化为肝细胞,细胞因子aFGF、bFGF、HGF和NGF生长因子在此体系中无明显的作用.     

Nesprin-1对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的影响

目的探讨nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的作用。方法采用悬滴-悬浮-贴壁三步法,5-氮杂胞苷(5-aza)与丹参共同诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,用Western blot与免疫荧光技术检测nesprin-1蛋白表达水平和在分化成熟过程中的改变。同时利用RNA干扰(RNAi)技术抑制nesprin-1蛋白的表达:Ⅰ组(RNA干扰目的序列AAAGCCAAGCACGCAACTA),Ⅱ组(RNA干扰目的序列GGGAACCAACAGTGAGATT),Ⅲ组(RNA干扰目的序列ACCAGGACATTGCGTACTA),对照组(使用无意义的ShRNA干扰序列),观察对胚胎干细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达水平有所变化。RNAi后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组心肌细胞分化率分别为(17.78±1.92)%、(36.67±3.34)%、(44.42±5.08)%和(77.78±1.92)%,各干扰组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),且各干扰组分化后心肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白(myosin)的表达量减少。结论 Nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中发挥重要作用,不同分子大小的nesprin-1亚型在此分化过程中可能有着不同的功能。     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

小鼠胚胎干细胞诱导为甲状腺细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为甲状腺细胞的可行性。方法E14小鼠ESCs诱导发育为拟胚体，再逐步添加促甲状腺素（TsH）、胰岛素（insulin）、KI等共培养。观察细胞分化过程的形态学变化，并以体外培养的成年小鼠甲状腺细胞为阳性对照；RT—PCR法检测甲状腺细胞分化相关基因TSHR、PAX8、NIS、TPO、Tg等表达情况：激光共聚焦显微镜双色荧光检测甲状腺细胞分化标记物PAX8和TTF-1的共表达；在荧光检测得甲状腺细胞分化率的基础上。送检电镜观察分化细胞的超微结构。结果诱导培养第6d分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR的表达；第8d检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR、TTF-1、PAX8、TTF-2的表达；细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论ESCs经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

血清和无血清诱导方法分化小鼠胚胎干细胞为定形内胚层的比较

目的 比较两种方法(血清诱导方法和无血清诱导方法)诱导小鼠胚胎干细胞分化为定形内胚层细胞的效率.方法 利用血清诱导法和无血清诱导法分别诱导分化小鼠胚胎干细胞,根据定形内胚层表面标记蛋白(Cxcr4、c-Kit和E cadherin)的表达,通过流式细胞术分析定形内胚层诱导的时间及效率,并利用RT-PCR检测两种方法诱导的定形内胚层基因表达谱;同时利用荧光定量PCR检测无血清诱导过程中内胚层基因的表达情况;利用流式细胞术分选Cxcr4和c-Kit双阳性细胞进行定形内胚层基因表达的鉴定.结果 血清诱导法和无血清诱导法都能够将胚胎干细胞诱导分化为定形内胚层,其中无血清组的诱导效率高于血清组,高达74.19％,并且在诱导的第4天就能到达峰值.结论 建立了高效快捷的诱导胚胎干细胞分化为定形内胚层细胞的方法,为进一步向肝、胰等组织细胞诱导打下了基础.     

小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB）阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,撤除丝裂原,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果经选择培养基培养3?d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,nestin呈阳性。加入血清进一步诱导,可分化出β-Ⅲ-tubline阳性的神经细胞。结论小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段,可直接诱导分化为神经细胞,并且前期可得到大量的神经前体细胞。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

体外诱导小鼠胚芽干细胞分化为肝细胞的实验研究

目的寻找一种诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞定向分化的最佳诱导剂。方法分离提取孕11 d小鼠胚胎的原始生殖细胞,体外培养扩增后,一部分胚芽干细胞接种到6孔培养板中。向不同孔中分别加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、β-神经生长因子（β-NGF）、维甲酸（RA）、肝细胞提取液进行诱导分化。另一部分胚芽干细胞与胎肝组织共培养。将培养12 d的细胞采用靛青绿摄入试验和白蛋白（ALB）免疫细胞化学染色来鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的情况。结果与胎肝组织共培养和添加了β-NGF、肝细胞提取液的胚芽干细胞能够诱导成肝样细胞,这些肝样细胞能够摄取ICG并表达ALB,上述3组细胞ALB阳性细胞数较对照组明显增多（P〈0.05）。bFGF、EGF、RA并无诱导分化作用。结论β-NGF、胎肝组织产生的细胞因子及肝细胞提取液中的细胞因子可诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞分化。     

淫羊藿苷诱导鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的作用

干细胞移植治疗心肌坏死性疾病是一种比较理想的治疗手段。胚胎干细胞以其分化的全能性成为了目前研究的热点。淫羊藿苷是一种历史悠久、无毒副作用的传统补药,除有抗氧化作用、调节内分泌、抗肿瘤等作用外,其益气强心之功效越来越受到人们的重视。探索淫羊藿苷诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的作用,为心肌损伤的干细胞治疗提供最佳的细胞资源     

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为软骨样细胞的初步研究

目的全反式维生素A酸(RA)联合转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-2(BMP2)等多种因子定向诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化,探索这几种细胞因子对ESC的成软骨定向诱导分化作用.方法小鼠ESC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养扩增,在1 ×10.mol/L全反式RA条件下制备拟胚体(EB),贴壁后联合应用TGF-β1及BMP2诱导分化,经形态学、免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞性质.结果 ESC在悬浮培养下,经RA初步诱导后给予TGF-β1及BMP2等因子继续诱导,贴壁后EB周边可爬出多角形分化细胞,诱导分化细胞和EB表达Ⅱ型胶原和软骨发生早期特异性转录因子Scleraxis.结论在RA预诱导EB分化后,TGF-β1和BMP2等因子可定向诱导小鼠ESC表达软骨特异性相关基因和蛋白,为胚胎干细胞成为软骨组织工程种子细胞提供了可能.     

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为软骨样细胞的初步研究

目的 全反式维生素A酸(RA)联合转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-2(BMP2)等多种因子定向诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化,探索这几种细胞因子对ESC的成软骨定向诱导分化作用。方法 小鼠ESC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养扩增,在1×109mol/L全反式RA条件下制备拟胚体(EB),贴壁后联合应用TGF-β1及BMP2诱导分化,经形态学、免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞性质。结果 ESC在悬浮培养下,经RA初步诱导后给予TGF-β1及BMP2等因子继续诱导,贴壁后EB周边可爬出多角形分化细胞,诱导分化细胞和EB表达Ⅱ型胶原和软骨发生早期特异性转录因子Scleraxis。结论 在RA预诱导EB分化后,TGF-β1和BMP2等因子可定向诱导小鼠ESC表达软骨特异性相关基因和蛋白,为胚胎干细胞成为软骨组织工程种子细胞提供了可能。