大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁。8～10 d可达80%～90%融合,纯化后传代周期为6～8 d。流式细胞术鉴定表明CD45阴性,CD29阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的 建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，为组织工程支架研究提供细胞基础。方法 分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法，对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中，将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性，流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化，并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能，通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果 改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一，细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论 改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜...     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。     

SD大鼠骨髓基质干细胞的全骨髓培养与鉴定

目的：采用体外全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）并进行鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CD45的表达。结果：全骨髓培养法能迅速、有效地培养和获得大量骨髓基质干细胞,流式细胞仪检测显示CD29阳性率为99.0%,CD34阳性率1.5%,CD45阳性率0.8%。结论 ：全骨髓贴壁培养法是获得骨髓基质干细简捷、高效、经济的途径,可以获得较纯的BMSCs。     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法。方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测。结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR。hMSCs细胞周期分布显示:G0/G1期(86.4±3.8)%,S G2 M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性,MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05)。结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法。     

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。     

微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法.方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测.结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR.hMSCs细胞周期分布显示:G 0/G 1期(86.4±3.8)%,S+G 2+M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性, MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05).结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法.     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

全骨髓培养法对大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的探讨一种易操作、高效的分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。方法采取全骨髓培养法分离和纯化大鼠MSCs,用显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测mMSCs纯度和形态特征,观察MSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化的能力。结果全骨髓培养法培养的MSCs具有良好的贴壁性,形态均一,流式细胞仪检测:CD45、CD90分别为1.3%、98.6%。第3代MSCs经适当诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论全骨髓培养法从大鼠骨髓中分离培养出的MSCs纯度较高,稳定性好,且操作相对简便。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性.方法采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达.结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降.流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性.细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)%,其中S期为(4.12±2.35)%;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)%,说明大部分细胞仍然处于静止期.流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征.结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞方法的建立

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,并在体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。方法：利用Percoll梯度分离法、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增hMSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、IBMX及胰岛素定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hMSCs,hMSCs具有独特的细胞免疫学表型,即CD73、 CD105、CD166、CD90及CD44阳性,CD34、CD31及CD45阴性。诱导3 d后,hMSCs细胞内有小脂滴出现,诱导2周后,脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。结论：成功建立hMSCs分离培养方法,体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构

目的：培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据。方法：体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs,用5-氮杂胞苷（5-Aza,10 μmol•L^-1）体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构。结果：流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs。hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin。透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接。结论：体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特性的心肌样细胞。     

人骨髓间质干细胞分离和培养扩增方法的研究

目的 :探索分离、纯化及培养成人骨髓间质干细胞 (hMSC)的最佳方法。方法 :采用Ficoll Paque淋巴细胞分离液和全血接种两种方法分离成人MSC ,筛选体外培养hMSC适合的培养基和适宜的血清含量 ,流式细胞仪检测hMSC表面抗原表达。结果 :经Ficoll Paque淋巴细胞分离液分离后 ,接种于 φ =10 0mL/L胎牛血清的L DMEM培养液 ,细胞贴壁良好 ,增殖速度快 ,hMSC在体外扩增 5代可获得 1× 10 8细胞。全血接种分离hMSC ,细胞贴壁慢、少 ,生长情况欠佳。除L DMEM ,其他类型的培养基均不适合hMSC的培养扩增。流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD44、CD10 5、CD166表达阳性 ,CD14、CD3 3、CD3 4、CD3 8、CD45、CD11a为阴性。结论 :用Ficoll Paque淋巴细胞分离液分离骨髓单核细胞 ,接种于 φ =10 0mL/LFCS的L DMEM培养液 ,分离培养扩增hMSC的效果最好     

巴马香猪骨髓间充质干细胞的分离扩增及初步鉴定

目的建立巴马香猪骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分离、培养、扩增的方法,并进行鉴定。方法采用梯度离心法分离并结合贴壁筛选法传代纯化培养猪的MSCs;采用倒置相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD71、CD34的表达率。结果原代培养的MSCs于6h后贴壁,贴壁细胞呈集群生长趋势。培养7～9d后可见细胞融合,14～21d达到95％融合。第3代细胞表面标记物CD71阳性率为95％,CD34阳性率为O％。结论采用全骨髓梯度离心法分离并结合贴壁筛选法能够成功分离和培养巴马香猪的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs。     

兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.     

Bmi-1基因表达与人骨髓间充质干细胞增殖关系的探讨

目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养体系,研究hMSCs表面抗原的表达情况,以及体外传代培养对Bmi-1基因表达变化的影响,为进一步探讨Bmi-1基因在hMSCs增殖中的作用及调控机制提供依据.方法:骨穿抽取骨髓,以1.077g/ml的Ficoll分离液梯度密度离心,收集单个核细胞进行培养和传代,观察细胞形态和生长周期.取P4代的hMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况.通过SA-β-gal的染色检测细胞的老化程度,通过抽提各代次细胞的RNA,逆转录PCR定量Bmi-1基因量的变化,分析与细胞倍增代数的关系.结果:体外培养的hMSCs贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆.经分离纯化培养后,流式细胞仪显示细胞表型为CD13,CD105,少量表达CD33,不表达造血细胞的标志CD34及CD117.SA-β-gal的染色显示随细胞培养时间延长,SA-β-gal染色更明显和清晰.逆转录PCR显示随传代次数的增加,hMSCs的增殖能力逐渐下降,Bmi-1基因表达随培养时间而减少.结论:本培养体系可获得纯度较高的hMSCs,具有强大的增殖能力.Bmi-1基因极可能是影响MSC增殖能力的一个重要基因.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

人骨髓间质干细胞体外扩增、冻存及初步鉴定

目的 探索人骨髓间质干细胞(hMSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏的方法.方法 无菌条件下抽取骨外伤髓内钉固定手术髓腔内容物,应用Ficoll-Paque分离液分离hMSC,通过传代扩增细胞,"慢冻速融"进行细胞冻存、复苏;流式细胞仪检测hMSC的表面标志.结果 hMSC容易分离获取、体外扩增迅速、冻存复苏简便,复苏后细胞形态保持不变.流式细胞仪检测结果显示,CD34、CD45阴性,CD29及CD71、CD90阳性表达率分别为96.9%,99.1%及4.1%.结论 hMSC库有望建立,为组织工程、细胞移植的研究提供种子细胞.