儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型检测及临床研究

目的探讨儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及简并引物扩增并测序,利用Genbank核对分型,检测东营地区2008年1月-2012年2月63例临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎患儿脑脊液中的肠道病毒(EV)RNA,并结合临床特点进行分析。结果 63例病毒性脑膜炎、脑炎患儿的脑脊液经RT-PCR检测,EV感染阳性率为74.6%(47/63)。利用通用引物筛选出的阳性标本,并采用简并引物经两次PCR共获得阳性结果 31例(66.0%)。随机抽取23条阳性片段进行克隆测序,测序结果与Gen Bank标准EV毒株进行同源性对比分析,相关序列同源性均在97%以上。肠道病毒引起中枢神经系统感染的临床特征在各个年龄组有所不同,33例急性期EV患儿脑脊液中白细胞数不同程度增高(均数76×106/L)。结论 EV是儿童无菌性脑膜炎、脑炎的最主要的病原体。采用RT-PCR可以快速准确的检测出中枢神经系统感染的肠道病毒;采用分型引物扩增并测序,将EV的VP1部分序列与GENBANK中的EV标准毒株进行对比,根据基因序列的同源性进行EV型别鉴定是一种切实可行的方案。EV引起的病毒性脑膜炎临床症状一般较轻、无特异性,多数患儿CSF中白细胞高于正常范围。     

感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型研究

目的探讨感染中枢神经系统肠道病毒(EV)的分子生物学分型。方法收集脑炎患儿脑脊液(CSF)样本72例,以EV71、COXB3、ECHO30标准病毒株为阳性对照,脑外科手术患儿CSF为阴性对照。采用通用引物和2种分型引物对CSF样本进行扩增,并对扩增产物进行分型研究。结果利用通用引物1次和2次PCR EV阳性检出率分别为69.44%(50/72)、73.61%(53/72),差异无统计学意义(P0.05);对VP1段进行PCR扩增,1次和2次PCR后,阳性检出率分别为26.42%(14/53)、62.26%(33/53),差异有统计学意义(P0.01);对VP2段进行PCR扩增,1次和2次PCR后,阳性检出率分别为16.98%(9/53)、54.72%(29/53),差异有统计学意义(P0.01);2种分型引物对EV RNA阳性检出率差异无统计学意义(P0.05);EV阳性样本与EV标准毒株相关序列同源性均在97%以上。结论利用分型引物能够检测临床常见EV的大多数血清型,可为防治EV引起的中枢神经系统感染提供临床参考。     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

小儿肠道病毒中枢神经系统感染的临床特点

目的探讨小儿肠道病毒（EV）中枢神经系统感染的临床特点。方法采用逆转录聚合酶链反应和病毒基因序列分析方法,对87例无菌性中枢神经系统感染病儿的脑脊液标本进行检测,并对其中61例EV中枢神经系统感染病儿的临床特点和预后进行回顾分析。结果无菌性中枢神经系统感染病儿中EV感染的发生率是70.10%,其中脑膜炎40例（65.57%）,脑炎21例（34.43%）。21例脑炎病儿的脑脊液标本经分型引物检测,17例（80.95%）阳性,其中埃柯病毒12型9例,柯萨奇病毒B3型5例,埃柯病毒7型1例,柯萨奇病毒B5型1例,柯萨奇病毒A9型1例。61例EV中枢神经系统感染均为急性起病,5—10月份高发（85.25%）,发病年龄高峰在3~5岁（44.26%）。EV脑膜炎的主要特征是脑膜刺激症状和脑脊液细胞数增加,主要临床表现为发热、头痛、呕吐,较大儿童可诉有乏力、畏光、肌痛,婴幼儿常伴有腹泻和皮疹。EV脑炎根据主要症状临床分型为昏迷型（3/21）、癫痫型（3/21）、精神障碍型（1/21）、小脑炎型（1/21）、脑干脑炎型（2/21）和混合型（11/21）。常规治疗后脑膜炎和大部分脑炎病儿完全恢复。4例重型柯萨奇病毒B3型脑炎病儿GLASGOW昏迷评分均〈7分,其中1例完全康复;1例运动障碍,经1年康复治疗后生活自理;1例癫痫、1例精神障碍伴癫痫,均可被药物完全控制。结论 EV是小儿中枢神经系统感染最常见的病原体之一;脑膜炎临床症状一般较轻,预后良好;大部分脑炎症状较轻,预后良好,重症脑炎可留有程度不同的后遗症。     

SARS冠状病毒Mc区克隆及序列分析

目的：构建SARS冠状病毒（SARS-CoV）GD322株M基因膜内区（Mc区）重组表达质粒，并对目的序列进行序列分析。方法：根据GenBank中公布的SARS-CoV Tor2株M基因序列，设计一对引物，采用RT-PCR法从SARS-CoV GD322株基因组中扩增Mc区．克隆至pET-32a（＋）载体中，转化大肠杆菌BL21后测序，利用Clustal X分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVMc区翻译的氨基酸序列的差异。结果：测序结果表明该区与Tor2株对应核苷酸序列同源性为100％。与已收集的81株SARS-CoVMc区所译氨基酸（Mc蛋白）相比，与77株（占95．1％）Mc蛋白完全同源．与4株（占4．9％）仅有一个氨基酸改变。结论：本试验成功构建SARS-CoV Mc区重组表达质粒：SARS-CoV各毒株间Mc蛋白氨基酸序列差异极小，提示利用任一毒株Mc蛋白制备单抗和疫苗具有普遍意义．     

2014-2019年山东省潍坊市流行的肠道病毒A组71型的VP1区基因特征分析

目的 了解2014—2019年山东省潍坊市流行的肠道病毒A组71型（EV71）VP1区基因遗传特征、进化关系及VP1区密码子所处的选择性压力。方法 随机选取2014—2019年潍坊市EV71感染手足口病患者的阳性标本，经人横纹肌肉瘤细胞分离培养后提取病毒总RNA，采用反转录聚合酶链式反应对VP1区基因扩增后进行序列测定，并分析与EV71各基因型代表株的核苷酸及氨基酸的同源性，构建2008年以来我国不同省份EV71及本地EV71 VP1区系统进化树。通过Datamonkey在线服务器采用单似然祖先计数（SLAC）及固定效应可能性模型（FEL）方法对C4a亚型VP1区密码子进行选择性压力分析。结果 共获得的41株本地EV71毒株，均与C4a基因亚型的同源性最高，核苷酸同源性为94.9%～98.2%，氨基酸同源性为98.3%～99.6%。系统进化树显示本地EV71毒株均属C4a基因亚型，形成2个明显的支系，每一分支中既有成簇毒株也有散在分布毒株，并与多地毒株亲缘关系较近。采用SLAC和FEL分别鉴定出136和190个密码子为负向选择性压力位点，不存在正向选择性压力位点。结论 2014—201...     

无菌性脑膜炎暴发中病原学检测及埃柯30型肠道病毒的基因特征和分子进化分析

目的 了解引起福建省泉州地区2011年无菌性脑膜炎暴发疫情的埃柯30型肠道病毒(echovirus 30,ECHO30)病原及基因特征,分析基因变异情况及进化来源。 方法 对泉州市2011年无菌性脑膜炎暴发疫情中的临床样本采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)核酸检测,随机选5份阳性样本进行肠道病毒VP1区核苷酸序列测定,将测序所得VP1序列用BLAST程序在GenBank上序列搜寻比对,确定其基因型, 并通过构建进化树分析其遗传进化规律。 结果 47份样本经rRT-PCR检测,有39份非EV71和Cox A16的其他肠道病毒核酸阳性, 5份阳性样本的肠道病毒VP1区核苷酸序列均为876 bp,且同源性最高,均大于98.9%,最高仅相差一个核苷酸,与它们具有较高同源性的均是ECHO30。与本次分离株亲缘关系最近的一组ECHO30分别是2008年河南省和浙江省的分离株,与中国台湾2001年无菌性脑炎分离株以及印度2011年分离株则距离较远;原型株Bastianni和20世纪90年代美国分离株和本次分离到的ECHO30毒株距离最远。 结论 2011年ECHO30在泉州地区发生一定程度的传播流行,并导致无菌性脑膜炎疫情的局部暴发流行,进化树分析表明本次分离株与国内近年ECHO30分离株亲缘关系较近,而与国外分离株则相对较远。     

湖北省手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VP1基因特征

目的 了解湖北省手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的VP1基因特点,研究该省EV71和Cox A16的基因型别及分子进化特征。方法 对2014-2015年湖北省26株EV71和27株Cox A16流行株的VP1基因测序,分析其同源性和遗传进化特征。结果 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株VP1核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性均较高,EV71流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为97.6%~100.0%和92.3%~100.0%。Cox A16流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为96.6%~100.0%和92.3%~100.0%。EV71的VP1基因系统进化分析表明,湖北省流行的EV71与我国其他地区流行的EV71均位于一个大的分支上,均为C4基因型的C4a亚型。Cox A16流行株与B1b亚型代表株位于同一分支上,主要为B1b亚型。结论 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株分别为C4a亚型和B1b亚型,其核苷酸和氨基酸与国内外其他地区的手足口病病毒株均有较高同源性。     

临床手足口病肠道病毒71型VP1基因分析

目的对临床手足口病(HFMD)的病原体肠道病毒71型(EV71)分离株VP1基因测序分析,从分子水平探究HFMD的分子遗传进化变迁情况。方法收集2015年1月至2016年12月期间在延安医院临床就诊疑似HFMD患者590例,采集粪便标本,用实时荧光PCR法进行EV71病毒核酸检测,对EV71检测阳性粪便样本进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP1目的基因,扩增阳性产物进行测序和序列比对,分析同源性并确定其所属基因亚型,并构建种系遗传进化发育树。结果共检出EV71型50例,检出率为8.47%(50/590例),2015年检出28例,2016年检出22例。50例中≤5岁35例,5-18岁13例,≥18岁2例;男性占64.00%(32/50例),女性36.00%(18/50例),女性患者中包括2例成人HFMD患者。检出的50株EV71毒株均为EV71C4亚型。检出的EV71毒株与国内北京和安徽以及马来西亚地区的毒株遗传距离为0.026,与浙江、广东地区毒株的遗传距离为1.52,与澳大利亚地区毒株的遗传距离为2.11。结论亲缘关系进化树显示,EV71毒株2年间未发生大的基因遗传变异。EV71毒株与北京、安徽以及马来西亚EV71流行毒株遗传距离较近,与浙江、广东等地的EV71流行毒株遗传距离较远,与澳大利亚分离的EV71毒株遗传距离最远。     

115例抗-HEV E2-IgM、IgG阳性感染者HEV RNA检测与基因分型研究

目的对戊型肝炎暴发人群中115例抗-HEV E2-IgM、IgG阳性感染者进行病毒RNA检测和基因分型研究，探讨其临床意义。方法对收集的暴发人群中115例抗．HEV E2-IgM、IgG均阳性人员血清和23例戊型肝炎患者粪便标本，采用通用引物进行逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）扩增戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅳ型基因片段，并进行测序和同源进化分析。结果从被检血清中扩增出8例戊型肝炎病毒阳性RNA基因片段，阳性毒株之间核苷酸同源性在97．3％～100％之间，进化树分析提示阳性毒株与戊型肝炎病毒基因Ⅳ型距离最近，与日本株和中国原型株的同源性分别为93．3％～95．3％和86．7％～87．3％；粪便标本中未能检测到戊型肝炎病毒RNA。结论本次急性戊型肝炎暴发流行由戊型肝炎病毒基因型Ⅳ型导致，暴发毒株与日本株有更近的亲缘关系；高灵敏度引物和取样时机是提高戊型肝炎病毒RNA检出率的前提。     

应用手足口病病原体验证改良的DNase-SISPA方法检测未知病毒感染的特异性

目的以引起手足口病的肠道病毒EV71为研究对象,在DNaseI-非序列依赖的单引物扩增技术的基础上建立感染性疾病RNA病毒性病原体的检测方法。方法根据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2008年版)附件手足口病实验室检测方案(试行),收集临床诊断手足口病的患儿粪便,经实验室RT-PCR检测阳性后,进行过滤、DNase消化处理。反转录、合成病毒RNA的双链cDNA,Taq I酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因,测序并进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增粪便标本中外源核酸得到多个DNA片段;将所有PCR产物克隆测序,有的序列与已知病原EV71基因序列同源性达99%;有的序列与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) strain CDC 54007同源性达81%。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测粪便标本中的RNA病毒性病原,并应用该改良技术检测到单核细胞增生李斯特菌。     

用通用引物建立的RT-PCR诊断肠道病毒性脑炎及脑膜炎

目的　用通用引物建立逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），达到广谱、特异及快速诊断肠道病毒（ＥＶ）性脑炎及脑膜炎。方法　用针对ＥＶ基因组５’端非编码区保守区的１对通用引物建立的ＲＴ－ＰＣＲ检测多种ＥＶ标准血清型，同时检测病毒性脑膜炎和脑炎患儿的脑脊液。结果　此种ＲＴ－ＰＣＲ可检测４２种ＥＶ的标准血清型，所用毒株在１０－１ＴＣＩＤ５０时仍可见到１９４ｂｐ的阳性条带。检测了３２例病毒性脑膜炎和脑炎患儿的脑脊液中ＥＶ－ＲＮＡ，１８例为阳性（５６．３％）。ＥＶ－ＲＮＡ阳性患儿的昏迷、瘫痪、抽搐、ＣＳＦ－蛋白质及低密度灶数（ＣＴ）分别为４（２２．２％）、８（４４．４％）、１２（６６．７％）、４６２ｍｇ／Ｌ（ｘ）及４（２２．２％）；ＥＶ－ＲＮＡ阴性患儿的昏迷、瘫痪、抽搐、ＣＳＦ－蛋白质、及低密度灶数（ＣＴ）分别为１０（７１．４％）、６（４２．９％）、１２（８５．７％）、３８６ｍｇ／Ｌ（ｘ）及４（２８．８％），仅昏迷发生率有极显著差异（Ｐ＜０．０１）。结论　用通用引物建立的ＲＴ－ＰＣＲ诊断ＥＶ性脑膜炎和脑炎，具有广谱性、特异性、敏感性及简洁、快速的特点，诊断ＥＶ性脑膜炎和脑炎主要依靠病原学检查。     

西安地区健康儿童肠道病毒隐性感染状况调查

[目的]了解西安地区健康儿童肠道病毒隐性感染状况,为手足口病防治提供依据。[方法]2010年6～7月采集828份健康儿童肛拭子标本进行肠道病毒病原分析,在2010年9月采集312份1～4岁健康儿童血液标本检测肠道病毒71型IgG抗体。[结果]健康儿童肠道病毒携带率为6．28％（52／828）,在1～4岁儿童中肠道病毒71型IgG抗体阳性率为34．62％（108／312）。儿童血清EV71中和抗体阳性率与年龄的关系尤为密切,儿童年龄越小,抗体阳性率越低,随着年龄的增长,儿童感染EV71的抗体阳性率不断增加。[结论]肠道病毒核酸检测不能完全代表健康儿童肠道病毒隐性感染状况,肠道病毒71型IgG抗体阳性率随年龄增长迅速增高。其中≤3岁儿童最为明显,属于HEV71感染引起手足口病流行的易感人群。     

肠道病毒中枢神经系统感染病儿免疫功能紊乱与神经元损害的相关性

目的通过检测肠道病毒（EV）中枢神经系统感染病儿脑脊液中白细胞介素-10（IL-10）、γ-干扰素（IFN-γ）及神经元特异性烯醇化酶（NSE）的水平,探讨EV引起病儿免疫功能紊乱的机制。方法收集2008年1月—2009年1月青岛大学医学院附属医院和滨州医学院附属医院临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎病儿的急性期脑脊液标本100例。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,检测标本中的EV RNA;应用双抗体夹心ELISA法检测EV感染组和对照组脑脊液中IL-10、IFN-γ及NSE的表达水平。结果 100例急性期病儿脑脊液中,经RT-PCR和二次PCR共获得阳性结果78例（78.0%）;EV感染组IFN-γ的表达水平高于对照组（t=4.24,P〈0.01）,重症组高于轻症组（t=4.13,P〈0.01）;IL-10表达水平低于对照组（t=7.89,P〈0.01）,重症组低于轻症组（t=2.97,P〈0.01）;NSE表达水平高于对照组（t=7.02,P〈0.01）,重症组高于轻症组（t=2.79,P〈0.01）。EV感染组NSE与IFN-γ水平呈正相关（r=0.673,P〈0.05）,与IL-10水平呈负相关（r=-0.587,P〈0.05）。结论 IL-10和IFN-γ参与EV对中枢神经系统免疫损害的过程,并与神经元的损害程度密切相关。     

IFN-γ＋874位点单核苷酸多态性和蛋白表达水平与肠道病毒71感染关系

目的研究干扰素Ⅱ型（IFN-γ）基因＋874位点单核苷酸多态性及IFN-γ在血清中表达水平与肠道病毒71（EV71）感染的关系,探讨EV71感染的遗传易感因素。方法取急性期手足口病病儿粪便进行病毒分离,序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）技术检测EV71感染者及正常对照儿童IFN-γ基因第一内含子＋874位点T/A单核苷酸多态性;ELISA法测定血清中IFN-γ的表达水平。结果 78例手足口病病儿中有43例为EV71感染。EV71感染病儿血清中IFN-γ的水平显著高于正常对照组（t=6.477,P〈0.01）。EV71感染病儿IFN-γ基因型与对照组比较差异有显著性（2χ=6.149,P〈0.05）。EV71感染病儿等位基因频率与对照组比较差异有显著性（2χ=7.486,P〈0.05）。EV71一般感染组IFN-γ基因型分布与脑炎组相比,差异无显著意义（P〉0.05）,脑炎组IFN-γ等位基因A频率明显高于一般感染组（χ2=6.211,P〈0.05）。结论 IFN-γ表达水平和其基因第一内含子＋874位点多态性与EV71感染有关,与是否发生EV71脑炎有一定相关性。     

逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒

目的建立一种检测肠道病毒71型（EV71）快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。方法针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型（CA16）无交叉反应发生。所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为1.0×102copies/mL。RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致。结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测。     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价

目的利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。方法通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法,对研究数据进行Kappa一致性分析。结果 SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。结论本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。