印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌侵袭能力的关系

目的:研究印记基因SLC22A18(solute carrier family 22,member 18)在乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌侵袭能力的关系。方法:采用Transwell方法评估2种不同恶性程度的乳腺癌细胞株MDA-MB-231(恶性程度高)和MCF-7(恶性程度低)的侵袭转移能力。分别采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测SLC22A18的mRNA和蛋白在这2种乳腺癌细胞株中的表达情况。结果:MDA-MB-231细胞株恶性程度高,穿过膜的细胞多,侵袭能力强;MCF-7细胞株恶性程度低,穿过膜的细胞少,侵袭能力弱;SLC22A18在MCF-7中的mRNA和蛋白表达水平高于MDA-MB-231;差异有统计学意义(P0.01)。结论:印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌细胞的侵袭能力相关,该基因有望作为一个抑癌基因抑制乳腺癌的转移。     

Stathmin表达水平与乳腺癌细胞侵袭能力相关性研究

目的 探讨乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中Stathmin基因表达水平与细胞生长、黏附、侵袭等生物学行为之间的关系,为进一步研究乳腺癌转移机制奠定实验基础。方法 应用RT-PCR和Western Blot方法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中Stathmin基因的表达水平,同时利用细胞增殖试验、细胞黏附试验和细胞侵袭试验检测MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长、黏附、侵袭能力,分析Stathmin表达与细胞的生长、黏附、侵袭能力之间的关系。结果 RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Stathmin基因在MDA-MB-231和MCF-7细胞中表达均高于正常对照细胞(F=10.173,P<0.05),且MDA-MB-231细胞中的表达水平明显高于MCF-7细胞中的表达水平(t=4.562,P<0.05)。而MDA-MB-231细胞在生长、黏附和侵袭能力方面均强于MCF-7细胞(P<0.05)。结论 Stathmin表达水平高的乳腺癌细胞相应的生长、黏附、侵袭能力较强,Stathmin表达水平与细胞侵袭能力密切相关。     

人乳癌细胞小球藻CvFad3基因的表达和作用

目的构建真核表达载体pEGFP-C3-n-3,检测小球藻n-3脂肪酸脱氢酶基因CvFad3在人乳癌MCF-7细胞中的表达和作用。方法通过RT-PCR法扩增得到CvFad3基因,将CvFad3基因cDNA插入到真核表达载体pEGFP-C3中,构建重组表达载体pEGFP-C3-n-3,并将其转染入MCF-7细胞中,设空载体pEGFP-C3为对照组。采用RT-PCR检测CvFad3基因的表达,MTT法分析CvFad3基因对MCF-7细胞增殖的影响,气相色谱检测CvFad3基因对MCF-7细胞n-3多不饱和脂肪酸含量的影响。结果构建的重组载体pEGFP-C3-n-3转染入乳癌MCF-7细胞48 h后可检测到CvFad3基因mRNA的条带,而转染pEGFP-C3的MCF-7细胞48 h后检测不到CvFad3基因mRNA的条带。与对照组比较,转染pEGFP-C3-n-3的细胞MTT吸光度明显降低（t=6.039,P〈0.01）;人乳癌细胞MCF-7细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量显著升高。结论重组载体pEGFP-C3-n-3构建成功,CvFad3基因能在MCF-7细胞内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖,增加了细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量。     

硫酸乙酰肝素在MDA-MB-231细胞增殖抑制中的作用

目的:探讨硫酸乙酰肝素(heparan sufate,HS)在抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖过程中对葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated pr otein,GRP78)及相关凋亡蛋白表达的影响.方法:培养人乳腺癌上皮MCF-7细胞株,生长达汇合期及汇合后期时收集培养液,提取其中的HS链.采用噻唑蓝比色法检测HS对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用.采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.应用Westem blot法分别检测GRP78蛋白和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果:HS对MDA-MB-231细胞增殖有明显的抑制作用,且具有剂量和时间依赖性(P<0.05).HS可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,并随着剂量的增大,细胞的凋亡率升高(P<0.05).HS抑制MDA-MB-231细胞GRP78蛋白的表达(P<0.05).HS可促进Bax蛋白表达(P<0.05),但抑制Bcl-2蛋白的表达(P<0.05).结论:HS通过减少MDA-MB-231细胞的GRF78、Bcl-2的表达,增加Bax表达来促进肿瘤细胞的凋亡,发挥其抗肿瘤作用.     

Tectonic家族成员1对T47D细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察乳腺癌细胞Tectonic家族成员1(Tectonic family member 1, TCTN1)表达变化,探讨下调其表达对T47D细胞增殖及细胞周期的影响。方法 取对数生长期MCF-7、MDA-MB-231、T47D细胞及正常乳腺MCF-10A细胞,采用实时荧光定量PCR法检测TCTN1 mRNA相对表达量,筛选出TCTN1 mRNA相对表达量最高的T47D细胞进行后续试验。取对数生长期T47D细胞,分为转染组(转染siRNA-TCTN1)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作处理)。转染48 h,采用实时荧光定量PCR法检测3组TCTN1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测TCTN1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞周期;转染后培养0、24、48、72、96 h,采用CCK-8法检测细胞增殖率。结果 MCF-7、MDA-MB-231、T47D细胞TCTN1 mRNA相对表达量(3.120±0.893、2.839±1.102、5.932±0.938)均高于MCF-10A细胞(1.023±0.182)(P<0.05),T47D...     

miR-335和Fra-1在乳腺癌中的表达及相互关系

目的 探讨微小RNA-335(miR-335)和Fos相关抗原1(Fra-1)在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达,以及二者的关系。方法 收集41例乳腺癌患者癌组织和对应的癌旁组织（2 cm<距癌组织边缘<3 cm）,检测不同组织、乳腺癌细胞系（MDA-231和MCF-7）和正常乳腺细胞系（MCF-10A）中mi R-335、Fra-1 mRNA和Fra-1蛋白表达。向乳腺癌细胞系（MDA-231和MCF-7）分别转染含mi R-335的质粒（mi R-335 mimic）和对照质粒（mimic control）,分析过表达的mi R-335对Fra-1 mRNA和Fra-1蛋白表达的影响。采用Pearson相关分析评估mi R-335与Fra-1的相关性。结果 与正常乳腺细胞系（MCF-10A）比较,乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-231）中mi R-335 mRNA表达降低（P<0.05）,Fra-1 mRNA和Fra-1蛋白表达均升高（P<0.05）。与癌旁组织比较,乳腺癌组织中mi R-335表达降低（P<0.05）,Fra-1 mRNA和Fra-1...     

沉默环磷腺苷效应元件结合蛋白1对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的：探究环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB1）基因沉默对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法：针对人CREB1的基因序列设计并构建2条短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），采用慢病毒转染shRNA至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系抑制其CREB1的表达。将实验组分为shCREB1#1组和shCREB1#2组，同时将shSCR空载质粒转染至上述细胞系作为阴性对照组。采用实时定量PCR和Western-blot法检测转染效率；CCK-8法检测细胞的增殖能力；集落形成实验检测细胞的集落形成能力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力；Western-blot法检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。结果： 在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，相较于shSCR组，shCREB1#1和shCREB1#2组中CREB1基因的mRNA和蛋白表达水平均下降（P＜0.001）。沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移和侵袭能力减弱且细胞的凋亡率升高（P＜0.05）。此外，沉默CREB1可使细胞周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达水平下调而促凋亡蛋白Caspase 3和Bax的表达水平上调。 结论：沉默CREB1可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力并诱导细胞凋亡。     

μ阿片受体通过调控Smad2抑制乳腺癌细胞迁移侵袭

目的:研究μ阿片受体(MOR)对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响及其机制。方法:Western blot(WB)及RT-q PCR检测乳腺癌细胞系MCF-7、BT-549、SKBR3、MDA-MB-231、BT-474、T47D中MOR的表达水平。在MDA-MB-231细胞中,慢病毒转染过表达MOR。用划痕实验、transwell实验以及WB实验来研究MOR表达量改变对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移的影响及可能的机制。结果:WB及RT-q PCR结果示,MOR在MDA-MB-231中的表达量明显低于MCF-7、BT-549、SKBR3、BT-474、T47D。划痕实验及transwell实验示,过表达MOR后MDA-MB-231细胞愈合、迁移及侵袭能力明显减弱。WB结果示,与对照组相比,过表达组的Smad2、p Smad2、MMP9、MMP2、N-cadherin表达量下调。结论:与MCF-7等低转移潜能细胞相比,MOR在高转移潜能乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达量低。过表达MOR后,MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力减弱。WB结果提示MOR对MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响可能与Smad2及其下游蛋白的表达下调有关。     

乳腺癌干细胞的有效富集

目的 探讨MCF-7细胞、BT474细胞和MDA-MB-231细胞微球体形成的影响因素,并检测其CD44+ CD24-/low的表达比例,明确富集干细胞的方法,以获得稳定数量的干细胞.方法 将MCF-7、BT474和MDA-MB-231乳腺癌细胞进行微球体培养,取培养第7天的微球体细胞分别进行干细胞表型的FCM检测分析...     

人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究

目的建立人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐药模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐药模型(MDA-MB-231/Epi),探讨其生物学特性。方法采用Doc和EPi低浓度逐步加量诱导法历时12个月分别建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药细胞株。通过细胞形态学观察、MTT法和流式细胞术分析、比较其生物学特性,实时荧光定量PCR检测多药耐药基因(MDR1)mRNA表达,Western Blot法检测P糖蛋白(P-gp)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)的表达状况。结果所构建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株可分别在12nmol/L Doc和800nmol/L Epi中稳定生长,在相同的药物浓度下,耐药细胞株的生长增殖率明显高于亲代细胞,其耐药指数分别为亲代敏感细胞的8.32倍和64.93倍,且相互呈交叉耐药状态。与亲代细胞相比,两株耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、处于S期的细胞减少,随撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快。两株耐药株的MDR1基因表达水平增高,分别为亲代细胞的4.05倍和5.96倍,P-gp表达为阳性。与MCF-7细胞株相比,MDA-MB-231细胞株ER、PR、HER2表达阴性,是典型的三阴性乳腺癌细胞株。结论成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐药细胞株,其生长及耐药性稳定。     

TNF-α可诱导乳腺癌细胞凋亡

目的研究TNF-α对乳腺癌的影响。方法采用RT-PCR和WesternBlotting分析30例乳腺浸润性导管癌及癌旁正常乳腺组织,乳腺正常上皮细胞系及乳腺癌细胞系中TNF-α的表达情况;采用流式细胞术观察TNF-α对乳腺癌细胞凋亡的影响。结果RT-PCR和Western Blotting结果碌示,TNF-αmRNA和蛋白在乳腺癌组织中表达都明显低于配对的癌旁正常组织（P〈0．05）,在乳腺上皮细胞系中表达均高于乳腺癌三利一细胞系,流式细胞术检测结果显示与未处理组桐比．经TNF-α处理的MDA-MB-435S（16．7±0．31）和MCF7（18．6±0．42）细胞的凋亡率明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论TNF-α可促进乳腺癌细胞的凋亡,TNF-α可为乳腺癌的治疗提供新靶点。     

巨噬细胞迁移抑制因子受体CD74与乳腺癌转移及预后的相关性

目的：研究巨噬细胞迁移抑制因子受体CD74在乳腺癌细胞株MCF-7和MDAMB-231以及人乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌患者预后的关系。方法：应用荧光定量聚合酶链式反应（fluorescentquantitativepo[ymerasechainreaction,FQ-PCR）和蛋白质印迹（Westernblotting）方法分别检测不同转移潜能乳腺癌细胞株MCF-7和MDA—MB-231CD74的mRNA和蛋白表达量,并比较CD74在两者间的表达差异;应用免疫组织化学检测89例乳腺癌组织中CD74的表达情况,分析CD74与乳腺癌患者总生存率和无瘤生存率的关系。结果：高转移潜能乳腺癌细胞株MDA—MB-231中CD74表达显著高于低转移潜能细胞株MCF-7（P〈0．001）。CD74表达水平是乳腺癌总生存率（P=0．001）和无瘤生存率（P〈0．001）的独立预测因素。结论：CD74的表达水平与乳腺癌患者预后呈负相关。     

人乳腺癌上皮细胞miR-217对DNMT1调控作用的研究

目的 验证在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达,为后期动物实验和临床试验提供实验基础.方法 利用瞬时转染技术,在对应细胞系中,过表达、抑制miR-217,Western blot检测各实验组中DNMT1蛋白表达,并用含有miR-217野生型及突变型识别位点的DNMT1 3′UTR载体质粒分别转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性改变.结果 过表达miR-217,DNMT1表达下降;抑制miR-217,DNMT1表达增高;双荧光素酶检测实验,DNMT1-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于DNMT1-UTR-MUT,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217对DNMT1表达具有调控作用,且miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达.     

Caprin-1 is a novel microRNA-223 target for regulating the proliferation and invasion of human breast cancer cells

MicroRNAs (miRNAs) are 21–22 nucleotides regulatory small non-coding RNAs that inhibit gene expression by binding to complementary sequences especially the 3’ untranslated region (3’UTR) of mRNA. One miRNA can target many messenger RNAs, leading to a complex metabolic network. Previous studies have shown that miRNA-223 regulates migration and invasion of tumor cells and targets cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1 (Caprin-1). In the present study, we detected the expression of miRNA-223 and Caprin-1 in MCF-7, T-47D and MDA-MB-231 cancer cell lines, and MCF-10A normal breast cell line, and analyzed the role of miRNA-223 in Caprin-1-induced proliferation and invasion of human breast cancer cells. We found that miRNA-223 expression levels are significantly lower in MCF-7, T-47D and MDA-MB-231 cancer cells than in MCF-10A normal breast cells, while Caprin-1 expression is higher in cancer cells than in normal breast cells. The most malignant cancer cell line MDA-MB-231 has the lowest expression of miR-223, but the highest expression of Caprin-1. Further, we found that miR-223 targets the 3’UTR of Caprin-1 miRNA and down-regulates the expression of Caprin-1. We also found that over-expression of Caprin-1 can promote the proliferation and the invasion of breast cancer cells, but miRNA-223 can inhibit the proliferation and the invasion. miRNA-223-induced inhibition can be reversed by ectopic over-expression of Caprin-1. These findings suggest that miR-223 may suppress the proliferation and invasion of cancer cells by directly targeting Caprin-1. Our study also indicates that expression levels of miR-223 and Caprin-1 can be used to predict the state of cancer in breast cancer patient.     

TRAIL联合Res对乳腺癌MDA-MB-231细胞DR和Caspase表达的影响

目的研究TRAIL联合白藜芦醇（Res）对乳腺癌MDA-MB-231细胞DR和caspase表达的影响。方法MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞表面DR4、DR5蛋白的表达;分光光度法检测caspase-3、caspase-8相对活性;荧光定量PCR检测DR4、DR5及caspase-3、caspase-8 mRNA的表达。结果50μmol／L和100μmo/L,Res分别与50ng／mL TRAIL联合作用后,对MDA-MB-231细胞增殖的抑制率及细胞凋亡率分别与单独应用相应浓度的Res和TRAIL比较,均存在显著差异（P〈0．01）。50μmol／L和100μmol／LRes分别与50ng／mLT RAIL联合作用后,caspase-3、caspase-8的相对活性与对照组及单用TRAIL、Res比较均明显增强,差异显著（P〈0．01）。Res作用后,细胞表面DR4、DR5荧光指数与对照组比较明显增强。荧光定量PCR结果显示与对照组比较．Res作用后DR4、DR5mRNA表达上调;与单独用药比较,TRAIL联合Resetcagpase-3、easpase-8 mRNA表达上调。结论TRAIL和Res联合应用对诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡具有明显的协同效果,其作用机制可能与增加DR和caspase活性有关。     

Tamoxifen-resistant human breast cancer cell growth: inhibition by thioridazine, pimozide and the calmodulin antagonist, W-13.

Estrogen receptor (ER)-negative human breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MDA-MB-435) and ER-positive derivatives of the MCF-7 cell line selected for growth in the presence of antiestrogens (LY2 and RR) were used as in vitro models of tamoxifen-resistant human breast cancer in this study. The sensitivity of the tamoxifen-sensitive (MCF-7) and tamoxifen-resistant human breast cancer cell growth to two noncytotoxic neuroleptic drugs, pimozide and thioridazine, and the anticalmodulin agent, W-13, were compared. Inhibition of cell growth was measured as a decrease in cell number following a 72-h incubation with drug. Growth of the ER-negative cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-435 was inhibited by all three drugs. The average Ki values in these two lines were 6.3 and 3.8 microM for pimozide and 4.1 and 15 microM for thioridazine, respectively. Both ER-negative cell lines were more sensitive than MCF-7 cells to growth inhibition by W-13. MCF-7 cells selected for antiestrogen resistance were sensitive to growth inhibition by W-13 and thioridazine (LY2, average Ki = 10.4 microM; RR, average Ki = 5.2 microM). LY2 and RR cells were resistant to pimozide except when treated with estradiol (Ki = 4.6 and 7.9 microM, respectively). Pimozide, thioridazine and W-13 all exerted different effects on the distribution of human breast cancer cells within the cell cycle, suggesting that each drug may utilize a distinct pathway for inhibition of cell growth. We conclude that all three drugs are potential noncytotoxic alternatives to tamoxifen for the treatment of tamoxifen-resistant human breast cancer.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞生长及迁移的影响

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响及对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的影响。方法：MCF-7细胞培养贴壁之后,加入EGCG处理,2d后收集蛋白,采用Western Blot检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（phospho-p38MAPK）的表达;同样处理后收集活细胞,用细胞计数法检测细胞的存活;取对数生长期的MDA-MB-231细胞,分至6孔板培养,使用EGCG处理后,采用细胞划线法探测乳腺癌细胞的迁移。结果：使用EGCG处理乳腺癌细胞后,phospho-p38MAPK的表达降低,EGCG处理乳腺癌细胞4d后其增殖率降低50%,迁移活性降低。结论：EGCG处理乳腺癌细胞能抑制肿瘤细胞的生长以及迁移,这与p38 MAPK信号通路相关。