补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞因其获取容易、创伤微小、具有无限扩增和多分化潜能、自体移植不存在免疫排斥反应而受到医学研究者的青睐。 目的：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，观察不同浓度补肾活血中药含药血清对其增殖的影响。 设计：完全随机对照的动物实验。 单位：广州中医药大学第一附属医院髋中心。 材料：选用健康雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量170-180g，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。将实验动物按随机数字表分为4组，正常对照组和高、中、低剂量给药组，每组10只. 方法：实验于2005-01/03在广州中医药大学实验动物中心完成。采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养，建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系。高、中、低剂量给药组大鼠分别灌胃补肾活血中药4.4，2．2和1．1g/kg，分别相当临床成人用量的20，10和5倍。正常对照组灌胃纯净水。连续给药1周。末次给药1h后，无菌条件下，腹主动脉取血6mid只，2000r／min离心15min，收集血清。高、中、低剂量给药组用10％大鼠含药血清代替10％的牛血清，正常对照组的培养基加入10％的血清。每天观察并记录细胞生长情况，绘制生长曲线。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的生长状况。②HE染色和吉姆萨染色观察骨髓间充质干细胞形态。③免疫细胞化学法检测骨髓间充质干细胞的抗原表达。④不同浓度含药血清对骨髓间充质干细胞生长情况的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞的生长状况：原代培养的骨髓细胞24h后开始贴壁，7d后可达80％融合。②骨髓间充质干细胞的一般形态：骨髓间充质干细胞的细胞多成长梭形或多角形，细胞体积小，胞核位于胞中或稍偏，核浆比略大。③髓间充质     

中药诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:某些中药可以诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化.骨髓间质干细胞向成骨分化的潜能,与中药治疗骨质疏松症、骨折、骨坏死、骨缺损等骨相关疾病有着理论上的相通性.目的:了解中药诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的发展现状,为进一步的研究奠定基础.方法:由第一作者检索2000-01/2010-06中国期刊全文数据库(CNKI)(http://www.cnki.net/)及Pubmed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed).中文检索词为"中药,骨髓间充质干细胞,成骨分化".英文检索词为"chinese herb,mesenchymal stem cells,osteogenic differentiation".文献检索语种限定为中文和英文,纳入中药单体、单味中药、中药复方等及其含药血清在体内或体外对人或动物骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究文献,排除重复研究.结果与结论:共纳入32篇文献,有关骨髓间充质干细胞研究背景的文献2篇;有关单味中药的文献5篇,其中补肾药4篇,补气药1篇;有关中药复方的文献10篇,其中补肾方6篇,补肾活血方4篇;有关中药有效组分的文献15篇.补肾、补气及活血类中药可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,但以补肾类中药为主,在一定程度上阐释了"肾主骨"理论的科学内涵,并为体外大量扩增骨髓间充质干细胞、促成骨分化及组织工程骨提供了更多的种子细胞来源.     

中药诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：某些中药可以诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化。骨髓间质干细胞向成骨分化的潜能,与中药治疗骨质疏松症、骨折、骨坏死、骨缺损等骨相关疾病有着理论上的相通性。目的：了解中药诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的发展现状,为进一步的研究奠定基础。方法：由第一作者检索2000-01/2010-06中国期刊全文数据库（CNKI）（http：//www.cnki.net/）及Pubmed数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）。中文检索词为＂中药,骨髓间充质干细胞,成骨分化＂。英文检索词为＂chinese herb,mesenchymalstem cells,osteogenic differentiation＂。文献检索语种限定为中文和英文,纳入中药单体、单味中药、中药复方等及其含药血清在体内或体外对人或动物骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究文献,排除重复研究。结果与结论：共纳入32篇文献,有关骨髓间充质干细胞研究背景的文献2篇;有关单味中药的文献5篇,其中补肾药4篇,补气药1篇;有关中药复方的文献10篇,其中补肾方6篇,补肾活血方4篇;有关中药有效组分的文献15篇。补肾、补气及活血类中药可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,但以补肾类中药为主,在一定程度上阐释了＂肾主骨＂理论的科学内涵,并为体外大量扩增骨髓间充质干细胞、促成骨分化及组织工程骨提供了更多的种子细胞来源。     

骨康含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

背景:研究发现骨质疏松症与骨髓间充质干细胞的分化关系密切,随着年龄的增加,骨髓间充质干细胞绝对含量下降,向成骨分化能力减弱,向成脂分化能力增强。目的:在成脂诱导条件下,观察中药骨康含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分化特性的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。材料:清洁级6月龄新西兰大白兔4只,SPF级2月龄SD大鼠5只,购自广州中医药大学动物实验中心。中药骨康方的主要成分为丹参、补骨脂、淫羊藿等,含生药量1.43g/mL,由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供。方法:2只兔按4.8g/kg给予生药灌胃制备含药血清,相当于临床剂量的10倍,2次/d,每次间隔5h,连续灌胃7d;另2只兔给予等体积生理盐水灌胃。分别于最后1次给药后2h行心脏采血,离心后取上清,-20℃保存备用。密度梯度离心 贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶扩增纯化,将传至第4代的骨髓间充质干细胞按2×108L-1接种,加入成脂诱导液的同时,骨康组加入上述含药血清,对照组加入空白血清,均调整浓度为10%。主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志,油红O染色观察脂滴形成情况,计数脂肪细胞转化率。结果:第2代骨髓间充质干细胞均一性>90%,CD44呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达。培养第4,7,10天后,两组细胞中均含大小不等的橙红色脂肪滴,细胞核被脂滴挤于细胞一侧,骨康组脂肪细胞转化率均明显低于空白组(F=0.025~0.037,P<0.05)。结论:中药骨康含药血清可抑制成脂诱导剂对骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的促进作用。     

黄精含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制

背景:近年来,对传统单味中药有效成分、复方中药及含药血清调控骨髓间充质干细胞增殖与分化作用的研究已有报道,但鲜有涉及到机制的研究.目的:观察黄精含药血清体外对骨髓间充质干细胞增殖的影响,并分析其作用途径与机制.方法:雄性 SD 大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取;雌性 SD 大鼠以中药水溶液灌胃后定时取血制备含药血清.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,将传至 P3 代的细胞,制备成单细胞悬液接种于 96 孔培养板后,分别加入黄精含药血清及空白血清,各组血清浓度分别为培养液体积的 5%,10%,15%,20%,25%及30%.MTT 法检测黄精含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的影响;RT-PCR 检测各细胞因子 mRNA 表达:实时 PCR 检测粒细胞集落刺激因子 mRNA 表达.结果与结论:与空白血清组相比,体积分数10%的黄精含药血清具有明显促进骨髓间充质干细胞增殖的作用(P＜0.05),并显著促进粒细胞集落刺激因子 mRNA 的表达(P＜0.05).提示体积分数10%的黄精含药血清具有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用,可能与其促进粒细胞集落刺激因子 mRNA 表达有关.     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节.目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法.方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞.经传代扩增,细胞进一步纯化.取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果.利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线.结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱.PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变.结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法.     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

中药诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：近年来研究显示,中药在诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化起到积极作用。目的：综述中药诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的研究进展。方法：以＂中药,骨髓间充质干细胞,成骨细胞＂为检索词,检索万方医学数据库中2004年1月至2012年4月的文献,纳入中药诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的相关研究,最终入选18篇文章进行总结分析。结果与结论：中药血清药理学认为中药血清既能去除中药内未知的毒性又能反映中药的药效,在上述理论的指导下,许多学者将含补肾、接骨等中药血清应用于诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究。结果显示,这些单味中药、单味药提取物、复方药含药血清均可以促进体外培养的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞,具有安全、使用简便等特点。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.     

透骨消痛颗粒诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:研究表明,透骨消痛颗粒通过有效抑制细胞因子、基质金属蛋白酶3、氧自由基的生物效应来延缓关节宏观形态、软骨基质及软骨细胞退变的作用.目的:验证透骨消痛颗粒含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖和诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-12/2007-08在福建中医学院中西医结合研究院分子生物学实验室完成.材料:选用清洁级4周龄SD大鼠80只.透骨消痛颗粒,由巴戟天、杭白芍、青风藤、川芎等组成,由福州屏山药厂制作.方法:取72只SD大鼠随机分为5组,透骨消痛颗粒的水提物高剂量组、水提物中剂量组、水提物低剂量组、醇提物组各16只,空白对照组8只,分别以含14,7,3.5g/(kg·d)药量的水溶液2 mL灌胃,对照组以等量生理盐水2 mL灌胃,2次,d,连续给约3 d后,腹主动脉采血制备血清.从另8只4周龄SD大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,体外传代培养,取第2代骨髓间充质干细胞分为空白对照组、软骨诱导剂组及透骨消痛颗粒组,通过透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:采用MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖和免疫组织化学检测Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达.结果:透骨消痛颗粒含约血清各组均能促进骨髓间充质干细胞增殖,与空白对照组相比差异均有非常显著性意义(P＜0.01),中剂量约物浓度时达到最大效应(P＜0.01),中剂量1 h组与2 h组相比差异无显著性意义(P＞0.05).透骨消痛颗粒含药血清能增强Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达,与空白对照组相比差异有非常显著性意义(P＜0.01),与软骨诱导剂组相比差异有显著性意义(P＜0.05).结论:透骨消痛颗粒含药血清能有效促进骨髓间充质干细胞增殖和诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.     

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:既往研究证明益气活血方补阳还五汤具有抑制脑缺血及再灌注模型细胞凋亡、抗自由基等作用,但关于本方剂对干细胞分化影响的报道较少.目的:观察益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.设计、时间及地点:以细胞为对象,对比观察实验,于2006-03/2008-02在河南省中医药研究院国家中医管理局三级实验室进行.材料:清洁级一二月龄SD大鼠20只,雌雄各半,体质量100～150g.益气活血方由本院制剂室生产,选用当归60g,桃仁30g,川芎30g加水720mL,提取挥发油,备用.药渣及提取液加入黄芪1 200g,赤芍60g,地龙30 g,红花30g,再加入920mL.水,煎煮1h,滤过,药渣再加入8 640mL.水,煎煮1h,滤过,合并2次煎液,浓缩至600 mL.,加入挥发油及吐温-80 3 mL,混匀,装瓶进行高压高温消毒.每毫升相当于生药2.4 g.方法:采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使骨髓间充质干细胞得到扩增和纯化.将第10代的细胞悬液接种于直径40 mm塑料培养皿中,细胞生长达80%～90%融合时,加入含体积分数为0.10的FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养基培养24 h,益气活血方组而后换为含诱导液二甲业砜、丁羟茼醚、β-巯基乙醇、益气活血方诱导5h,对照组换为含诱导液二甲亚砜、丁羟茴醚、β-巯基乙醇诱导5h.主要观察指标:采用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞;用免疫细胞化学方法检测诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋向的表达.结果:经流式细胞仪检测显示,细胞表面标志CD90、CD106阳性,CD45、CD34呈阴性.免疫细胞化学方法检测显示,益气活血方组在诱导1,3h分化巢蛋白细胞与诱导5h分化的神经元特异性烯醇化酶细胞和胶质纤维酸性蛋白细胞,与对照组相比,差异显著(P<0.01).结论:益气活血方具有体外定向诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.     

补肾中药血清对成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响

背景:课题组拟以骨形态发生蛋白作为研究靶点来认识肾虚骨质疏松症的病理机制.目的:体外观察补肾中药血清对SD大鼠成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响.方法:采用多次胶原酶消化法体外培养获取新生SD大鼠颅盖骨的成骨细胞;随机将28只SD大鼠分为4组,分别灌胃补肾益精壮骨中药、补中益气颗粒剂和骨疏康颗粒,正常组不灌胃.干预8 d后,通过血清药理学方法使用各组大鼠血清培养成骨细胞48 h.结果与结论:与正常组相比,补肾组和骨疏康组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平明显增加(P < 0.01),补脾组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平降低(P < 0.01).结果表明补肾中药对成骨细胞保持自身功能、维持骨密度的作用上发挥重要的作用,成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7可能有促进成骨细胞分化、增殖的功能.     

补肾中药血清对成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响

背景：课题组拟以骨形态发生蛋白作为研究靶点来认识肾虚骨质疏松症的病理机制。目的：体外观察补肾中药血清对SD大鼠成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响。方法：采用多次胶原酶消化法体外培养获取新生SD大鼠颅盖骨的成骨细胞;随机将28只SD大鼠分为4组,分别灌胃补肾益精壮骨中药、补中益气颗粒剂和骨疏康颗粒,正常组不灌胃。干预8d后,通过血清药理学方法使用各组大鼠血清培养成骨细胞48h。结果与结论：与正常组相比,补肾组和骨疏康组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平明显增加（P〈0.01）,补脾组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平降低（P〈0.01）。结果表明补肾中药对成骨细胞保持自身功能、维持骨密度的作用上发挥重要的作用,成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7可能有促进成骨细胞分化、增殖的功能。     

比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性:推荐第3～6代细胞可用于临床

背景:人骨髓内间充质干细胞含量稀少,且随着年龄增加或体质衰弱细胞数量会逐渐减少,因此进行大量扩增非常必要,但目前关于扩增后各代骨髓间充质干细胞的生物学特性是否相同仍无准确定论.目的:分析比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性,着眼于推荐其应用于临床组织工程的实际需求.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/10在北京中医药大学附属东直门医院骨科和中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于非造血系统疾病的患者骨髓,由北京中医药大学附属东直门医院骨科提供.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.当细胞融合至90%以上时胰酶消化传代,定期在倒置显微镜下观察各代细胞形态变化,取第2代细胞用于指标检测.主要观察指标:细胞形态及免疫表型,MTT检测细胞活性,流式细胞仪分析细胞分裂及凋亡坏死比例.结果:传代培养的骨髓间充质干细胞形态均一,呈梭形、纺锤形,克隆样生长,培养至9代后生长减慢,并出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象.第2代细胞表面标志CD44,CD106,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45则呈阴性.骨髓间充质干细胞增殖到第9代MTT值达到最高,从第10代开始MTT值下降.细胞增殖到1 1代,分裂期细胞数量仍呈上升趋势,但从第6代开始凋亡细胞数量明显增加,第8代以后凋亡细胞数量达到60%以上.结论:通过对各代骨髓间充质干细胞生物学特性分析,推荐使用第3～6代骨髓间充质干细胞用于临床治疗使用.     

人骨髓MSC分离培养及诱导分化为脂肪细胞的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增人骨髓MSCs的方法,并探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化人骨髓间充质干细胞,并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果MgCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L-DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论骨髓MSCs体外增殖和传代能力强,通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增;骨髓MSCs在体外可诱导分化为脂肪细胞。     

壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子三维大孔支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景:干细胞的分化潜能与培养条件有密切关系,改变支架材料的表面特性,三维结构,增加生长因子均可实现对干细胞增殖分化的控制.目的:制备适合骨髓间充质干细胞附着生长的、具有最佳孔隙率和孔隙结构的药物缓释组织工程支架--三维大孔支架,提供能促进多能干细胞生长的微环境.设计:重复测量设计.单位:广州中医药大学基础医学院解剖教研室.材料:实验所用健康成年 SD 大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.壳聚糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司.方法:实验于2003-03/2006-12主要在广州中医药大学基础医学院解剖教研室完成.采用冷冻干燥的方法,用不同比例的壳聚糖.碱性成纤维细胞生长因子-明胶依次混匀,通过控制冷冻、复温和干燥时间处理使其具有最佳孔隙率和孔结构,制备具缓释碱性成纤维细胞生长因子功能的三维大孔支架.取SD大鼠股骨和胫骨骨髓,分离、培养骨髓间充质干细胞并移植于缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架上进行三维培养,与无碱性成纤维细胞生长因子的支架对照.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.主要观察指标:用ELISA和扫描电镜观察支架的三维结构和缓释性能,用苏木精-伊红染色、MTT、细胞计数及扫描电镜方法观察缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架对骨髓间充质干细胞生长状态和细胞活力的影响.结果:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能,孔隙尺寸与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架三维结构相比,差异无显著性意义(P＞0.05).含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能提高在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活率,促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖和活力,与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架相比,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能缓释碱性成纤维细胞生长因子,有利于在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活,为其在组织工程中的应用打下基础.     

丹参诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达

背景：骨髓间充质干细胞在适当的诱导条件下，可在体内外分化为神经细胞与神经前体细胞，但多数研究多以含血清及细胞因子的培养基为诱导剂。目的：以丹参作为诱导剂，观察骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达，拟寻找新的诱导方法。设计：以细胞为观察对象的重复观察测量，对照性体外实验。单位：四川大学基础与法医学院人体解剖教研室。材料：实验于2004-10／2005-12在四川大学基础与法医学院人体解剖教研室完成。为四川省重点实验室。SD大鼠，体质量150～200g，由本校动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。丹参注射液由安徽天洋药业有限公司提供，批号20050411。方法：采用密度梯度离心和细胞贴壁法培养骨髓间充质干细胞，取第5代细胞进行诱导。用丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，对照组以不含丹参注射液的无血清培养液进行培养。采用RT-PCR检测诱导前后细胞ngn-1，mash—1的表达，免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达。主要观察指标：①RT-PCR检测细胞诱导前后ngn-1，mash-1的表达。②免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达。结果：①骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好，大部分细胞贴壁呈长梭形。加入诱导剂后，细胞体积缩小，部分细胞有突起，形状类似神经元。②RT-PCR反应检测显示，未经诱导的骨髓间充质干细胞ngn-1，mash-1，mRNA为阴性，诱导后呈阳性表达。③细胞免疫组织化学检测显示，诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应，对照组为阴性。结论：丹参注射液能够诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。