CYP3A5参与急性白血病耐药机制的研究

目的探讨细胞色素P4503A亚家族多肽5(CYP3A5)在急性白血病(AL)耐药机制中的作用。方法RT-PCR、免疫组化、MTT法检测白血病细胞株、AL患原代细胞CYP3A5转录表达与细胞株对化疗药物敏感性、患化疗疗效及预后的相关性，检测化疗药物对CYP3A5的转录调控；构建CYP3A5重组质粒稳定转染HI，60细胞，观察细胞对化疗药物的敏感性是否改变。结果转录CYP3A5的K562、U937细胞与不转录CYP3A5的NB4、HL-60细胞相比，对柔红霉素明显耐受(耐药倍数均为2．1倍)；原发耐药组患初治时CYP3A5阳性率(17．2％)显高于持续完全缓解(CCR)组(0．4％)与继发耐药组初治时(5．4％)，早期复发组第1次完全缓解(CR1)时阳性率(23．9％)显高于CCR组CR时(1．3％)；柔红霉素可诱导K562／A02、HL-60／ADR细胞CYP3A5转录；HL-60细胞稳定转染CYP3A5重组质粒后明显耐受柔红霉素、长春新碱(耐药倍数分别为3．0，4．0倍)。结论白血病细胞表达CYP3A5可能使其原位代谢多种化疗药物，是直接导致AL耐药的机制之一。     

骨髓基质细胞-白血病细胞共培养模型中主要微环境成分对化疗敏感性的影响

背景：目前多数耐药机制研究均采用单细胞培养模型。目的：构建骨髓基质细胞．白血病共培养模型，探讨该模型中纤维连接蛋白、基质细胞膜蛋白及基质细胞因子等白血病微环境成分对白血病细胞化疗敏感性的影响。设计、时间及地点：开放性实验，于2006—03／10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成。材料：血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份，其中男6例，女5例，中位年龄34岁；经临床和血常规、骨髓涂片细胞检查确诊的未经治疗的急性淋巴细胞白血病患者骨髓标本13份，其中男7例，女6例，中位年龄28岁；每份骨髓1．0～2．0mL，50U／mL肝素抗凝。方法：①常规分离、培养骨髓基质细胞，Jurkat细胞与^60Co照射的基质细胞层黏附培养48h，收集上清，扫描电镜观。②2％戊二醛固定灭活基质细胞层，去除其细胞因子分泌功能，保留基质细胞膜蛋白。③通过MTT法测定柔红霉素的IC50、FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量细胞凋亡率。主要观察指标：采用倒置显微镜、扫描电镜及荧光显微镜对骨髓基质细胞、骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型及凋亡的Jurkat细胞进行形态学观察；通过流式细胞仪定量细胞凋亡率；MTT法测定IC50评价化疗药物敏感性。结果：①成功构建骨髓基质细胞-Jurkat共培养模型，扫描电镜发现Jurkat细胞通过伪足黏附于基质细胞层。②纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat细胞的细胞毒作用。③纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat的凋亡诱导效应。结论：骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型中微环境成分骨髓基质细胞膜蛋白、纤维连接蛋白和基质细胞因子均参与了Jurkat细胞耐药的形成。     

顺铂、拓扑替康、柔红霉素和羟基脲对人骨髓间充质干细胞的作用

我们曾研究一些白血病常用的化疗药物对人间充质干细胞（MSC）的影响,并发现其独特的耐药性。本研究评估一些实体瘤常用的化疗药物如顺铂、拓扑替康、柔红霉素和可长期使用的口服化疗药物如羟基脲等对人MSC的作用。在体外培养系统中,比较人MSC与NB4细胞系、人外周血单个核细胞（PBMC）对这些单一化疗药物的敏感性。单一化疗药物作用72小时后,继续将人MSC在正常培养液培养9天,用MTT方法测定细胞增殖恢复情况。Annexin V／PI染色后,用流式细胞仪检测上述4种化疗药物诱导的细胞凋亡。结果表明：人MSC对4种化疗药物均较NB-4细胞耐药,拓扑替康、顺铂、羟基脲和柔红霉素对人MSC的IC50分别是其对NB-4细胞的IC50的636倍、24．8倍、20倍以上和2．4倍,但人MSC对拓扑替康、顺铂和柔红霉素较人PBMNC更敏感,拓扑替康、顺铂和柔红霉素对人PBMNC的IC50分别是其对人MSC的IC,。的27倍以上、1．9倍和1．4倍。4种药物在临床浓度都明显抑制人MSC增殖,去除药物作用后,这种抑制作用持续存在。上述单一药物临床浓度作用于人MSC后48—72小时凋亡细胞增加。结论：顺铂、羟基脲、拓扑替康和柔红霉素单一药物均可造成人MSC持续损伤,其机制与细胞凋亡有关。     

多发性骨髓瘤耐药分子机制

多发性骨髓瘤的耐药与下列因素有关：靶细胞内药物浓度降低；药物靶细胞的改变；抑制药物诱导的凋亡；尤其是后者，现越来越受到重视。已发现许多基因及其突变、细胞因子、细胞与细胞或与细胞外基质的粘附、骨髓血管生成的增加等许多因素均参与骨髓瘤细胞抵抗药物诱导的凋亡。     

人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响

本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用RT-PCR技术检测MDR1基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0／G1期细胞比例增加（P〈0．05），S期细胞比例下降（P〈0．05），G2／M期细胞比例增加（P〈0．01）。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组K562细胞凋亡受阻（P〈0．05）。黏附培养未诱导K562细胞MDR1基因表达，也未使K562／ADM细胞的MDR1基因表达发生改变。结论：K562细胞与MSC黏附接触共培养，可导致K562细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与MDR1无关。     

多发性骨髓瘤耐药分子机制

多发性骨髓瘤的耐药与下列因素有关:靶细胞内药物浓度降低;药物靶细胞的改变;抑制药物诱导的凋亡;尤其是后者,现越来越受到重视。已发现许多基因及其突变、细胞因子、细胞与细胞或与细胞外基质的粘附、骨髓血管生成的增加等许多因素均参与骨髓瘤细胞抵抗药物诱导的凋亡。     

多发性骨髓瘤抗凋亡基因的表达及相关性分析

骨髓瘤细胞的永生化，即细胞凋亡受抑是多发性骨髓瘤（MM）发病、进展（复发耐药）的重要因素。MM细胞过度表达Bcl-2家族抗凋亡因子Bcl-2、Bcl—xL和Mcl-1，因此靶向Bcl-2等可大大降低肿瘤细胞的凋亡阈值，增强化疗敏感性。survivin是另一类凋亡抑制蛋白家族（IAP）中的最小成员，与多种肿瘤的耐药以及预后相关。我们在本研究中通过检测上述两类抗凋亡基因在骨髓瘤细胞的表达，探讨两类抗凋亡因素对骨髓瘤发生发展的意义及相互关系，明确其临床应用价值。     

三氧化二砷抑制K562/ADM细胞 P-糖蛋白表达并提高化疗药物的敏感性

目的 研究三氧化二砷（As2O3)对人多药耐药白血病细胞K562/ADM的诱导凋亡作用和对P-糖蛋白（P-gp)表达及功能的影响。以及As2O3与常规化疗药物对耐药细胞的联合效应。方法 以白血病多药耐药细胞系K562/ADM为As2O3作用的靶细胞，用MTT比色法检测细胞增殖活性。光镜，激光共聚焦显微镜和电镜观察形态学变化，流式细胞术进行细胞周期分析和P-gp表达的检测，激光共聚焦显微镜检测P-gp功能。结果 K562/ADM细胞对阿霉素（ADM）高度耐受，并与柔红霉素（DNR）和足叶乙甙（Vp16)交叉耐药，0.5-20.0μmol/LAs2O3抑制K562/ADM细胞增殖。抑制活性高于K562细胞。经As2O3诱导后K562/ADM细胞出现典型的凋亡形态学变化和亚G1期细胞比例增高等凋亡特征性改变。As2O3下调K562/ADM细胞P-gp的表达并抑制其功能，增加K562/ADM细胞对ADM，DNR和Vp16的敏感性。结论 As2O3能够诱导白血病多药耐药细胞凋亡。并通过抑制耐药细胞P-gp的表达和功能提高耐药白血病细胞对常规化疗药物的敏感性。     

Notch信号通路和多发性骨髓瘤

Notch信号通路是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一,调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化,是造血微环境调节造血细胞增殖与分化的重要信号通路,与多种血液系统恶性肿瘤的发病有关。多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是以浆细胞克隆性增殖为特征的B系肿瘤。由于骨髓瘤细胞的增殖比例低及多药耐药的形成,因此其对常规剂量的化疗药耐药,使得MM的临床治疗仍十分困难。近年来的研究发现,多发性骨髓瘤病人肿瘤细胞和骨髓瘤细胞株都大量表达Notch的配体Jagged-2,而正常的浆细胞或是其它恶性疾病来源的病人肿瘤细胞低量表达Jagged-2。Jagged-2可诱导基质细胞分泌白介素6（IL-6）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、胰岛素样生长因子－1（Insulin—like growth factor 1,IGF－1）。Notch信号通路激活后可通过与NF－κB,C—myc的相互作用,调节细胞的增殖,促进骨髓瘤细胞的生长,从而抑制骨髓瘤细胞的凋亡,它与骨髓瘤的发生和耐药有关。抑制Notch信号通路能诱导骨髓瘤细胞的凋亡,增强化疗药的细胞毒作用。研究表明,单独使用Notch信号通路的特异性化学抑制剂γ－分泌酶抑制剂（γ－secrctase inhibitors,GSI）可通过特异性阻滞Notch信号通路从而诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并且与传统化疗药物联合应用可以增强骨髓瘤细胞对化疗药的敏感性。本文就Notch信号通路的组成、Notch信号通路的作用机制及Notch信号通路与多发性骨髓瘤的关系进行综述．     

五味子甲素逆转多药耐药相关蛋白1多药耐药机制的研究

目的:探讨五味子甲素对表达多药耐药相关蛋白1的肿瘤耐药细胞株的逆转耐药作用及相关机制。方法:FCM测定不同浓度五味子甲素对柔红霉素抑制HL60/ADR生长及同一浓度五味子甲素对不同化疗药物抑制HL60/ADR和HL60/MRP细胞生长的影响;五味子甲素作用前后,HL60/ADR和HL60/MRP细胞内化疗药物柔红霉素和MRP1特异性底物二醋酸羧基荧光素积聚的变化。结果:25μmol/L五味子甲素可有效降低HL60/ADR、HL60/MRP对柔红霉素、长春新碱和依托泊甙的半数抑制浓度,逆转倍数分别是5,11,16和3,3,13倍;五味子甲素能够增加柔红霉素和MRP1特异性底物二醋酸羧基荧光素在细胞内的积聚。结论:五味子甲素可以逆转不同化疗药物对MRP1介导的耐药,其逆转机制与增加化疗药物的积聚能力有关。     

阿霉素诱导的骨髓瘤细胞化疗耐药的分子机制分析

本研究旨在探讨阿霉素诱导的骨髓瘤细胞RPMI8226化疗耐药的分子机制,分析Notch信号过度活化在化疗耐药机制中的作用.以浓度梯度递增法建立耐阿霉素的骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX,针对化疗耐药的瘤细胞RPMI8226/DOX,用RT-PCR法检测细胞耐药前后Notch2、Jagged1、Jagged2、HES1基因表达变化;Western blot检测耐药细胞系与敏感细胞系P-170蛋白表达变化;ELISA方法分析IL-6、VEGF水平变化.结果显示,Notch2、Jagged1、Jagged2基因随着耐药程度的增高表达逐渐增高,而HES1则相反,随着耐药程度增高表达逐渐减低.P-170蛋白随着耐药程度的增高表达逐渐增高.耐药细胞组培养上清中细胞因子VEGF和IL-6水平显著高于普通培养组.结论：建立的人骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX可以作为骨髓瘤耐药研究的有效模型,Notch信号通路的活化与多发性骨髓瘤的耐药密切相关,Notch信号通路有望成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点.     

激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

摘要多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节。Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一，它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚。本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用。利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch，ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株，以建立激活)Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系；采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡。结果表明：RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达、Notch-1及相关分子。逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达，激活Notch-1信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N，N-dimethylspingosine，DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论：：Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点．     

薏苡仁脂抗肿瘤转移反应性基因与微矩阵芯片技术分析

背景从中药薏苡仁中提取具有抗癌活性的康莱特注射液,被广泛应用于肺癌的治疗.实验表明,对多种肿瘤株,包括LA795肺转移具有明显抑制作用.运用基因芯片技术,寻找康莱特小鼠肺腺癌LA795模型肺转移的差异表达基因.目的应用基因芯片技术观察薏苡仁脂抗肿瘤转移反应性基因.设计以实验动物为观察对象的对照实验.单位中国中医研究院西苑医院肿瘤科.对象实验于2003-02/08在中国中医研究院西苑医院实验室完成.接种LA795肺腺癌瘤株的T739小鼠,共40只,随机分为2组,每组20只.方法以LA795肺腺癌小鼠肺转移组织,制备mRNA探针,应用含有4 096条鼠基因的cDNA表达谱芯片,用ScanAr ray 3000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,分析差异表达的基因.主要观察指标两组实验动物的差异表达基因.结果发现在康莱特治疗组和空白对照组存在差异表达的基因,其中重复3次均差异表达的基因有27条,均表达增高的基因25条,表达降低的基因2条.其中12条是小鼠肌cDNA文库中的基因.经观察发现6条可能为与肿瘤的发生与发展及转移相关的基因.结论运用基因表达谱芯片能够有效筛查出中药康莱特的相关差异基因.     

mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60/A细胞凋亡及耐药性的影响

为了探讨膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)抑制剂MK886对耐药白血病HL-60/A细胞诱导凋亡的作用及对其耐药性的影响,采用QT-PCR及Western blot法检测HL-60/A细胞mPGES-1的表达,CCK-8法观察药物对HL-60/A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA法检测PGE2的合成,Western blot法检测Akt、P-Akt表达,并观察低浓度(10μmol/L)MK886对HL-60/A细胞耐药性及多药耐药基因表达的影响。结果表明,HL-60/A细胞高表达mPGES-1,MK886可时间、浓度依赖性地抑制HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡(r=-0.83,P<0.05),同时,mPGES-1表达及PGE2合成减少,P-Akt表达明显下降。低浓度MK886可下调多药耐药基因mdr-1及蛋白P170表达,增强对化疗的敏感性。结论:MK886可抑制耐药白血病HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡,增强其化疗敏感性,其机制与下调mPGES-1/PGE2合成、抑制P-Akt蛋白及多药耐药基因表达有关。     

A novel stealth liposomal topotecan with amlodipine: apoptotic effect is associated with deletion of intracellular Ca2+ by amlodipine thus leading to an enhanced antitumor activity in leukemia.

The objectives of the present study were to define whether amlodipine induces apoptosis and what mechanism is involved in the process in human resistant and non-resistant leukemia cells following co-administration of stealth liposomal topotecan with amlodipine, a novel antiresistant liposomes developed by our institution. In three leukemias, K562, HL-60, and multidrug resistant (MDR) HL-60, cytotoxicity of topotecan was potentiated by amlodipine, while topotecan alone was resistant to MDR HL-60 cells. In two selected K562 or MDR HL-60 cells, the apoptotic effects were increased by addition of amlodipine, showing a dose-dependent manner. The activities of caspase 3 and 7 (marked as caspase 3/7), and caspase 8 were significantly activated by topotecan with amlodipine co-treated as the stealth liposomes. The deletions of intracellular Ca2+ stores induced by amlodipine correlated with the activated activities of caspase 3/7, or 8, respectively. In xenograft model with MDR HL-60 in nude mice, antitumor activity of stealth liposomal topotecan with amlodipine was significantly enhanced as compared to that of stealth liposomal topotecan or topotecan alone. In conclusion, apoptotic effect is associated with deletion of intracellular Ca2+ by amlodipine through activation of caspase 8 and then 3/7 activities. The enhanced antitumor activities by stealth liposomal topotecan with amlodipine are mainly due to the potentiating apoptotic effect and reversing the resistance by amlodipine. Stealth liposomal encapsulation of anticancer agent with a modulator may provide a novel strategy for improving the chemotherapeutic effects.     

Dehydroxymethylepoxyquinomicin, a novel nuclear factor-kappaB inhibitor, induces apoptosis in multiple myeloma cells in an IkappaBalpha-independent manner

Nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) is constitutively activated in multiple myeloma cells. Several proteasome inhibitors have been shown to be effective against multiple myeloma and may act by inhibiting degradation of IkappaBalpha. Here, we examined the biological effects of a new type of NF-kappaB inhibitor, dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ), which is reported to directly inhibit the cytoplasm-to-nucleus translocation of NF-kappaB. A multiple myeloma cell line, 12PE, which is defective for IkappaBalpha protein, was utilized to determine if IkappaBalpha is concerned with the action of DHMEQ. Meanwhile, U266 was used as a multiple myeloma cell line with normal IkappaBalpha. A proteasome inhibitor, gliotoxin, which is an inhibitor of degradation of phosphorylated IkappaBalpha, failed to inhibit translocation of NF-kappaB in 12PE. In contrast, DHMEQ equally inhibited translocation of NF-kappaB to the nucleus and induced apoptosis to both multiple myeloma cell lines, suggesting that apoptosis resulting from DHMEQ is IkappaBalpha independent. DHMEQ also induced apoptosis in freshly isolated multiple myeloma cells. After DHMEQ treatment, cleavage of caspase-3 and down-regulation of cyclin D1 were observed in both cell lines. In addition, administration of DHMEQ resulted in a significant reduction in tumor volume in a plasmacytoma mice model compared with control mice. Our results show that DHMEQ could potentially be a new type of molecular target agent for multiple myeloma.     

砷剂诱导多发性骨髓瘤细胞socs-1基因去甲基化作用的研究

本研究探讨三氧化二砷（As2O3）对人多发性骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226细胞内socs-基因甲基化状态的影响。用MTT法观察As2O3对骨髓瘤细胞增殖情况的影响，采用甲基特异性PCR法检测As2O3作用前后骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226 socs-1基因的甲基化状态，以实时定量PCR技术定量检测细胞株给药前后socs-1基因mRNA的表达变化，流式细胞技术检测As2O3诱导的骨髓瘤细胞的凋亡情况。结果表明：人骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226均存在不同程度的socs-1基因CpG岛甲基化，socs-1基因不表达的现象。As2O3作用72小时后socs-1基因甲基化程度明显减弱或消失，socs—1基因在mRNA水平上表达明显增强，与各野生型细胞株相比，差异具有显著性P〈0．05），且细胞生长抑制明显，早期、晚期细胞凋亡比率明显升高，并呈现剂量依赖性。结论：As：03可诱导socs—1基因甲基化状态的改变，使基因表达上调，恢复其活性，这为进一步阐明As2O3诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制和As2O3治疗多发性骨髓瘤的可能机制提供新的思路和新的研究方向。     

A genomic approach to identify molecular pathways associated with chemotherapy resistance

Resistance to chemotherapy in cancer is common. As gene expression profiling has been shown to anticipate chemotherapeutic resistance, we sought to identify cellular pathways associated with resistance to facilitate effective combination therapy. Gene set enrichment analysis was used to associate pathways with resistance in two data sets: the NCI-60 cancer cell lines deemed sensitive and resistant to specific chemotherapeutic agents (Adriamycin, cyclophosphamide, docetaxel, etoposide, 5-fluorouracil, paclitaxel, and topotecan) and a series of 40 lung cancer cell lines for which sensitivity to cisplatin and docetaxel was determined. Candidate pathways were further screened in silico using the Connectivity Map. The lead candidate pathway was functionally validated in vitro. Gene set enrichment analysis associated the matrix metalloproteinase, p53, methionine metabolism, and free pathways with cytotoxic resistance in the NCI-60 cell lines across multiple agents, but no gene set was common to all drugs. Analysis of the lung cancer cell lines identified the bcl-2 pathway to be associated with cisplatin resistance and the AKT pathway enriched in cisplatin- and docetaxel-resistant cell lines. Results from Connectivity Map supported an association between phosphatidylinositol 3-kinase/AKT and docetaxel resistance but did not support the association with cisplatin. Targeted inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway with LY294002, in combination with docetaxel, resulted in a synergistic effect in previously docetaxel-resistant cell lines but not with cisplatin. These results support the use of a genomic approach to identify drug-specific targets associated with the development of chemotherapy resistance and underscore the importance of disease context in identifying these pathways.