视细胞移植术后RCS鼠视网膜谷氨酸的分布

目的 通过纯视细胞移植,观察重建视网膜神经传导通路中兴奋性神经递质谷氨酸的分布和变化。方法取同龄Wistar鼠和皇家外科学院鼠(RCS)为供／受体,准分子激光切削法制备视细胞层,外路途径移入RCS鼠的视网膜下腔,术后两周取RCS鼠手术眼,手术对照眼,RCS对照眼,Wistar鼠眼。分别做冰冻切片,免疫组织化学染色法染色,普通光学显微镜下观察。结果在视细胞移植术后两周,移植视细胞存活,外丛状层重建,与手术对照眼、RCS对照眼相比,受体RCS鼠重建视网膜中在内丛状层和节细胞层Wistar鼠谷氨酸免疫反应阳性的神经纤维相对密度增多。结论视细胞移植不仅可以使RCS鼠视网膜重建正常的解剖结构,而且在移植后的视网膜中观察到兴奋性神经递质谷氨酸的分布接近正常。     

视网膜感光细胞纯化方法的研究

目的　探讨改进获取视网膜纯感光细胞的方法。方法　应用改良的准分子激光切削法和酶分层消化法来分离纯化视网膜感光细胞层。结果　由两种方法获取的视网膜组织片经苏木素 -伊红染色均证实为单一的纯感光细胞层并保持生物活性。结论　改良的准分子激光切削法和酶分层消化法均能获取视网膜纯感光细胞 ,且对细胞损伤小 ,内外节段保持完好 ,可为视网膜的移植创造条件。     

大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植观察

目的：鉴定骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外不诱导的条件下视网膜下移植后的定位。方法：体外培养雄性大鼠MSCs，直接作为细胞供体视网膜下移植于成年雄性大鼠视网膜下，4周后将动物处死，取眼球做石蜡切片，用Y染色体鉴定，为做进一步验证，将MSCs用重组腺相关病毒AAV－gfp感染后移植，分别于4、8周取动物眼球作冰冻切片，于荧光显微镜下做绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）表达观察。结果：培养的MSCs集落生长迅速，均一性好；Y染色体原位杂交鉴定表明来源于MSCs的阳性细胞融合入了原来的视网膜结构，在光学显微镜下可分布于视锥，视杆细胞层，双极细胞层及节细胞层；在荧光显微镜下可见GFP标记的阳性细胞存在，分布于视网膜色素上皮层、视锥，视杆细胞层，双极细胞层及节细胞层，细胞形态与结构同周围的视网膜相似；2种标记方法检测到的视网膜结构完整，未见到玫瑰花结样结构。结论：MSCs可在视网膜下移植后4周与原视网膜结构相融合，2种方法检测到的阳性细胞分布于视网膜色素上皮层，视细胞层，双极细胞层及节细胞层。     

鼠视网膜感光细胞移植术后超微结构观察

目的 以遗传性视细胞变性动物ＲＣＳ鼠为受体,Ｗｉｓｔａｒ鼠为供体,观察纯视锥、杆细胞移植术后ＲＣＳ鼠视网膜外层超微结构的变化。方法 应用视网膜板层切削技术或准分子激光技术制备供体层状视细胞;视网膜板层外路移植技术,获得视网膜移植动物模型。术后２周及４周时处死动物,眼球常规切片后于光镜及透射电镜下观察受体视网膜。结果 移植的视细胞大多成层排列于受体鼠的视网膜色素上皮层及内颗粒层之间。重新出现的外网状     

斑马鱼视网膜感光细胞的发育及视蛋白的表达

目的研究斑马鱼视网膜感光细胞的发育和视蛋白的表达，明确利用斑马鱼研究视网膜和感光细胞的可行性。方法制备斑马鱼视网膜感光细胞视蛋白（视杆细胞视紫质、视锥细胞紫外线视蛋白和视锥细胞蓝色视蛋白）的RNA探针。收集受精后72，96，120h的斑马鱼眼球组织进行切片、电镜观察和整体原位杂交。结果斑马鱼的神经视网膜分层排列，包括3个细胞层和2个丛状层。随时间发展，视网膜的发育逐渐成熟，3个细胞层的细胞排列更加整齐，感光细胞的外节盘发育更加成熟，3种视蛋白的表达逐渐增强，范围扩大。结论利用斑马鱼进行视网膜和感光细胞的研究是可行的，视蛋白可作为感光细胞的标记。     

视细胞移植术后RCS鼠视网膜 γ-氨基丁酸的分布观察

目的通过纯视细胞移植, 观察重建视网膜神经传导通 路中抑制性神经递质γ氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)的分布和变化。方法取同龄Wistar/皇家外科学院鼠(royal college of surgeon rat,RCS)为供/受体，准分子激光切削法制备视细胞层，外路途径移入RCS鼠的视网膜下腔，术后2周取RCS鼠手术眼，手术对照眼，RCS鼠对照眼，Wistar鼠眼。分别做冰冻切片，免疫组织化学染色法染色，普通光学显微镜下观察。测量内丛状层(inner plexiform layer,IPL)和节细胞层(ganglion cell layer,GCL)的光密度，计数无长突细胞的数量， 方差分析组间差异,配对t检验RCS鼠手术眼组内差异。结果在视细胞移植术后2周，移植视细胞存活，外丛状层重建 ，与手术对照眼，RCS对照眼相比，受体RCS鼠重建视网膜中内丛状层GABA免疫反应阳性 的神经纤维光密度测量值差异有显著性的意义 P < 0．001，而与Wi star鼠眼比较无明显区别。和手术对照眼，RCS对照眼，Wistar鼠组比，GABA能无长突细胞 (amacrine cell)明显增多(P<0．05)。节细胞层GABA阳性免 疫反应光密度测量值和上述几组比变化不明显(P>0．05)。接受移植的RCS鼠各部位的无长突细胞在移植部二侧和对侧赤道，后极部之间的差异无显著性 的意义( P = 0．3436)。结论视细胞移植不仅可以使RCS鼠视网膜重建正常的解剖结构，而且在移植后的视网膜中观察到抑制性神经递质GABA的分布接近正常，无长突细胞反应性增生。(中华眼底病杂志,2001,17:128-131)     

经巩膜外路至视网膜下腔移植视网膜细胞的实验研究

探讨视网膜光感受器细胞的移植方法及临床意义。方法将16只昆明鼠随机分为A组和B组,每组均8只鼠。于手术显微镜下,用特殊显微注射器穿过巩膜、脉络膜,在A组昆明鼠的视网膜下腔注入视网膜混合细胞,在B组昆明鼠的视网膜下腔注入纯光感受器细胞。于移植术后30、90及180 d摘除实验眼,于光镜下观察移植细胞在视网膜下腔生长的情况。结果大多数标本(13／15)HE染色显示视网膜细胞准确移植在受体眼的视网膜下腔,未见炎性细胞浸润和受体视网膜破坏;且移植到受体视网膜下腔的细胞在术后180 d仍存活。仅少数(2／15)标本可见受体视网膜结构破坏。移植的视网膜混合细胞均形成“玫瑰花”样结构,而移植的纯视网膜光感受器细胞则在视网膜下腔形成整齐的细胞层。结论经巩膜外路至视网膜下腔的显微注射法是较为理想的视网膜下腔注射给药和视网膜细胞移植方式。纯视网膜光感受器细胞移植后的生长状况和功能接近正常生理状态的视网膜组织结构,为临床治疗视网膜变性疾病提供了新途径。     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的：探索用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，经改良的内路法，不经玻璃体切割的情况下进行视网膜下间隙的移植，方法：用酶1（含220kU/L透明质酸酶和0．1％的胰蛋白酶）松解视网膜神经上皮细胞与RPE细胞之间的联接，再用酶II（含0．25％胰蛋白酶）从Bruch膜上离散RPE细胞，制成细胞悬液，用特制的注射针头，通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙，结果：术后2周供体RPE细胞层呈单层排列于受体视网膜下间隙，并存活，未见明显炎症反应，电镜观察，术后7周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘模型成镶嵌关系。结论：改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙，并至少存活7周，改良的内路法渴望为视网膜移植的实验室研究提供一条可供借鉴的途径。     

准分子激光切削视网膜板层移植术

目的 应用准分子激光切削视网膜获得纯视网膜光感受器层并制作视网膜板层移植的动物模型。 方法 准分子激光切削Wistar大鼠视网膜获得纯视网膜光感受器层,植于成年RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜下，术后1个月取材，切片，光镜下观察。 结果 准分子激光切削视网膜可获得均匀整齐的视网膜光感受器层，移植后1个月，光感受器层成活对位良好。 结论 准分子激光切削视网膜光感受器板层移植可获得具有较多移植细胞，并有良好解剖学对位的视网膜移植动物模型。 (中华眼底病杂志,1998,14:209-211)     

视网膜视细胞的成片移植

目的 探索用准分子激光切削技术制备视网膜单层细胞植片,经内入路视网膜下腔的单层视细胞成片移植。方法 用准分子激光对大鼠视网膜进行切削,制取单层视细胞植片,此后,按内入路手术方法进行了兔视网膜下腔的异种移植。结果 切削后所得视细胞植片由单层视细胞组成,结构完整,包括外丛状层、外核层和外节层;视细胞植片经明胶包埋后被准确植入宿主视网膜下腔中,移植术后第1,2天宿主观视网膜未能复位,呈脱离状态,移植物没能与视网膜色素上皮层相贴;移植后10天,宿主视网膜复位,视细胞移植片平铺于宿主视网膜下腔中,植片视细胞外节也宿主视网膜色素上皮层相贴;移植后10天,宿主视网膜复位,视细胞移植片平铺于宿主视网膜下腔中,植片视细胞外节与宿主视网膜色素上皮层相贴,未见明显免疫排异现象。结论 准分子激光制备单层视细胞植片方法简单、可行;初步观察到内入路单层视细胞成片移植后,视细胞植片能够在宿主视网膜下腔中以正常生理位置存活;视网膜下腔为理想的视网膜移植的受位。     

视细胞移植后RCS鼠视网膜超微结构观察

自八十年代以来视网膜移植在世界上蓬勃兴起 ,为临床上视网膜色素变性和黄斑病变等难治性眼病的治疗开辟了一条全新的道路。我们通过观察皇家外科学院 (royal college of sur-geon,RCS)大鼠 [1 ] 在接受正常 Wistar鼠的视细胞层后重建的视网膜超微结构 ,以了解视细胞移植术后 ,移植 Wistar鼠视细胞 ,RCS鼠视网膜超微结构的变化。1　材料和方法供体动物选用 Wistar雄性鼠 (体重约 2 0 0 g) ,受体鼠为雄性 RCS鼠 ,出生后 6 0 d,体重 180～ 2 0 0 g( 级实验动物 ,北京医科大学实验动物部提供 )。移植视细胞片的制备及视细胞移植见文献 [2 …     

视网膜干细胞移植任重而道远

进行性视网膜感光细胞的死亡是许多视网膜变性疾病的共同特征。现有的治疗方法不能恢复已经丧失的视功能。视网膜干细胞移植研究的不断深入在为视网膜变性患者带来希望的同时也面临一些严峻挑战：如何获得理想的视网膜干细胞？如何诱导视网膜干细胞分化成视杆及视锥细胞？如何诱导移植的细胞与受体细胞形成功能性突触连接？感光细胞丧失的早期,内部的视网膜神经通路是完整的,新的感光细胞只需与双极细胞形成突触连接就能恢复完整的视网膜神经通路。而感光细胞替换通常比其它神经元更直接更容易。因为感光细胞是感觉神经元,只在一个方向上与双极细胞一水平细胞形成连接。另外,视网膜特殊的层状结构决定了视网膜外层的感光细胞层是视网膜干细胞移植最理想的位置。视网膜干细胞研究的进展、视网膜变性疾病的特征及视网膜的特殊结构让我们有理由相信,干细胞移植的成功将首先来自视网膜感光细胞移植。     

兔視網膜色素上皮细胞移植的實驗研究

目的 探索用改良的二步法酶法制备视网膜色素上皮(RPE)细胞悬液,经改良的内路法,不经玻璃体切割的情况下进行视网膜下间隙的移植 方法 用酶Ⅰ(含220kU/L透明质酸酶和0.1％的胰蛋白酶)松解视网膜神经上皮细胞与RPE细胞之间的联接,再用酶Ⅱ(含0.25％胰蛋酶)从Bruch膜上离散RPE细胞,制成细胞悬液 用特制的注射针头,通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙 结果 术后2周供体RPE细胞层呈单层排列于受体视网膜下间隙,并存活,未见明显炎症反应 电镜观察,术後7周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘模型成镶嵌关系结论改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,并至少存活7周,改良的内路法渴望为视网膜移植的实验室研究提供一条可供借鉴的途径。     

人胚眼视网膜光感受器细胞的体外培养和鉴定

目的：探讨人胚眼视网膜光感受器细胞的获得和体外培养方法,为进行人类视网膜光感受器细胞移植提供理论依据。方法：采用酶分层消化法分离获取了胚眼纯视网膜光感受器细胞,使用视网膜色素上细胞的条件培养液,在体外长期培养并进行形态学鉴别;用苏木素－伊红染色显示消化后的视网膜组织结构层次,以确定所获得取的视网膜光感受器细胞的纯度;用抗视杆细胞特异性视紫质蛋白抗体（rhodopsin4D2,Rho4D2)免疫细胞化学染色做细胞鉴定,结果：酶分层消化法能获取较纯的视网膜光感受器细胞,抗Rho4D2阳性,并能在体外存活较长时间,结论：酶分层消化法所获取的人胚眼纯视网膜光感受感器细胞能在体外较长时间存活,并可表达光感受器细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞来源。     

激光损伤对BN大鼠视网膜缝隙连接蛋白Cx43分布的影响

目的探讨细胞间隙连接蛋白(connexin 43，Cx43)在(Brown Norway，BN)大鼠视网膜中的分布特点以及氪激光损伤视网膜后Cx43分布的变化。方法应用雄性BN为研究对象，氪红激光眼底光凝(波长647nm，能量360mw，光斑直径50μm，曝光0．05s)?右眼视盘周围10个激光点。光凝后1周开始取材，应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点。结果正常视网膜内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达，神经节细胞表达的主要位置是细胞浆和细胞膜，色素上皮细胞全层表达，内外颗粒层及内外丛状层无表达。激光损伤后的内界膜，视神经纤维层以及神经节细胞层Cx43表达明显减少，瘢痕区视网膜色素上皮细胞接近消失，而激光斑周边色素上皮细胞表达不受影响，激光斑部位增殖的成纤维样细胞部分表达。结论正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜、神经纤维层、视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层，激光损伤后内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层表达减弱，激光斑周围色素上皮细胞中表达无明显变化，激光损伤瘢痕中的成纤维细胞有少量表达。     

大鼠视神经损伤后移植人胚胎神经干细胞的实验研究

目的 探讨异种神经干细胞注射到玻璃体腔后迁移到视网膜的存活及分化，为进一步研究重建视觉传导通路奠定基础。方法在近SD大鼠眼球后壁夹住视神经根部5min，造成视神经损伤，将起源于人胚胎大脑海马的神经干细胞悬浮液注射到SD大鼠的玻璃体腔中。移植的神经干细胞预先用荧光染料Hoechst标记。分别于手术后不同的时间处死，剥离出视网膜，进行免疫组织化学染色，在荧光显微镜下观察实验结果。结果宿主视网膜在荧光显微镜下可见Hoechst标记阳性的移植细胞，移植前移植细胞神经胶质原纤维酸蛋白（GFAP）阳性表达的，移植后为阴性表达。结论视神经损伤大鼠的玻璃体腔内注射起源于人胚胎大脑海马的神经干细胞，移植细胞可以迁移到视网膜组织中存活。     

视网膜静脉阻塞的高压氧治疗电镜观察

目的 探讨高压氧治疗对视网膜静脉阻塞(RVO)后视网膜感光细胞层超微结构的影响。方法 通过氩激光光凝法制作兔眼RVO模型，对比观察高压氧治疗前后正常兔眼以及高压氧治疗(HBOT)1、3、5、10d与非HBOT RVO眼视网膜感光细胞层超微结构的改变。结果 非高压氧治疗(NHBOT)组RVO细胞线粒体外形膨大，内嵴肿胀、溶解，内质网肿胀、核糖体脱落、核膜溶解等损伤明显较HBOT组RVO眼为重；但也发现高压氧对正常兔眼视细胞线粒体造成一定损伤。结论 HBO对视网膜静脉栓塞后感光细胞层治疗有效，但应注意其毒副作用。     

玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入在视神经损伤中的作用

视网膜神经节细胞绝大部分位于神经节细胞层,可通过视神经通路将光感受器接收的视觉信息传递至高级视觉中枢,产生视觉。视网膜神经节细胞损伤和视神经轴突的中断,往往会导致视力下降甚至失明。近年来研究证实,玻璃体内细胞移植对损伤的视神经具有保护作用,为视神经损伤的修复治疗提供了新的方向。本文就玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入在视神经损伤中的作用展开综述。     

视网膜移植抗原性的初步研究

目的：探讨视网膜的免疫原性，为视网膜移植的免疫排斥提供理论依据。方法：采用C57BL/6小鼠，提供视网膜全层、感光细胞层，受体为BALB/C小鼠，并设立阳性及阴性对照组，测定脚掌皮肤迟发性超敏反应及细胞毒性淋巴细胞功能。
结果：①异种全视网膜移植引起了迟发性超敏反应(P<0.05)，而异种感光细胞移植未引起迟发性超敏反应(P>0.05)。②异种全视网膜移植后产生了一定的细胞毒性淋巴细胞功能，在1：90浓度下的杀死率为33.4%，明显高于阴性对照组(同种脾细胞为5.3%，同种全视网膜为4.8%，P<0.05)，而经过抗CD₈单克隆抗体处理后其毒性淋巴细胞功能消失。 结论：异种全层视网膜有一定的移植免疫原性，而异种感光细胞移植可能没有明显的移植免疫原性。 （中华眼底病杂志，1997，13：234-236）     

Wistar鼠和RCS鼠视网膜神经递质的分布和比较

目的：观察正常Wistar大鼠和皇家外科学院鼠（RCS）的视网膜兴奋性神经递质谷氨酸（Glutamate)和抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的分布和两者间的差异。方法：74天Wistar鼠和RCS鼠各6眼分为2组，免疫组织化学染色法，光镜下观察上述组织视网膜内谷氨酸和GABG的分布。结果：Wistar鼠视网膜AGBA阳性免疫反应分布于视网膜内丛状层的部分神经纤维、GABA阳性免疫反应的无长突细胞和节细胞层的部分纤维。RCS鼠则分布于视网膜内丛状层的少量神经纤维、极少量GABA阳性免疫反应的无长突细胞和节细胞层的部分纤维。Wintar鼠视网膜Glutamate阳性免疫反应主要分布于外丛状层、内丛状层及节细胞层的神经纤维。RCS鼠则主要分布于内丛状层及节细胞层的神经纤维。RCS鼠视网膜中Glutamate阳性免疫反应的神经纤维的相对密度和GABA阳性免疫反应的无长突细胞的相对密度减少。结论：74天时RCS鼠视网膜中的视细胞完全萎缩，使Glutamate和GABA的分布受到影响。