黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B，CYP24A mRNA及蛋白表达的影响

目的:通过研究黄芪多糖对成骨细胞增殖及1α羟化酶(CYP27B),24-羟基化酶(CYP24A)基因与蛋白表达情况的影响对其治疗骨质疏松症(OP)作用机制进行初步探讨。方法:以MC-3T3-E1成骨细胞为研究对象,实验分为5组,分别为正常组,维生素D组(1×10-5mmol·L-1),黄芪多糖高、中、低剂量组(10,1,0.1 mg·L~(-1))。用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的黄芪多糖在不同时间(24,36,48 h)对MC-3T3-E1成骨细胞增殖率的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B蛋白的表达情况。结果:MTT比色法显示黄芪多糖的质量浓度在0.1,1,10 mg·L~(-1)时可以提高MC-3T3-E1成骨细胞的增殖率,且在48 h促增殖作用最佳。Real-time PCR,Western blot检测结果显示,与正常组比较,维生素D组MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B mRNA表达量、蛋白表达量有显著促进作用(P0.05);与维生素D组比较,黄芪多糖在质量浓度为10,1,0.1 mg·L~(-1)时对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A mRNA表达量、蛋白表达量有显著抑制作用(P0.05)。结论:黄芪多糖能够治疗骨质疏松症其机制与提高成骨细胞活性及调节MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA及蛋白表达水平有关。     

左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响

目的:研究左归丸含药血清对间充质干细胞骨向分化过程中碱性磷酸酶含量变化的影响。方法:采用全骨髓贴壁法培养间充质干细胞,连续进行3次差速贴壁法纯化间充质干细胞。常规诱导组以β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C诱导间充质干细胞骨向分化,实验组在常规诱导组基础上加以左归丸含药血清。使用茜素红染色钙结节、碱性磷酸酶染色鉴定诱导成功。分别在0,7,14,21 d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。结果:全骨髓贴壁法和差速贴壁法联合使用可得到较为均一间充质干细胞。用比色法测得碱性磷酸酶含量随着诱导时间延长而增加。结论:大鼠间充质干细胞经药物诱导后可以分化为成骨细胞。左归丸含药血清能够促使诱导过程中碱性磷酸酶含量表达增加。     

补肾活血汤含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

【目的】探讨补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外成骨细胞分化的能力。【方法】用不同浓度的补肾活血汤含药血清干预BMSCs,7d后应用4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNPP）偶氮法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,21d后行茜素红染色（ARS）观察钙盐沉积情况判定成骨能力,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测Runx相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的基因表达以评估成骨能力。【结果】与空白血清组比较,补肾活血汤低、中、高剂量血清组BMSCs的ALP活性、茜素红染色面积及Runx2、OCN、OPN基因表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）。【结论】补肾活血汤可促进BMSCs向成骨细胞分化,其机制可能与上调Runx-2、OCN、OPN表达有关。     

强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的观察强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖的影响。方法使用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，5-溴脱氧嘧啶（Brdu）和CD44、CD54双重免疫组化鉴定，传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白血清对照组，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2组MSCs的生长情况。结果强肌健力口服液含药血清组以浓度依赖方式促进MSCs的增殖活力，与相应浓度的空白血清对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论补脾法（强肌健力口服液含药血清）能促进干细胞的生长。     

含药血清对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

方法：对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外培养、纯化，运用CD34、CD44、c—Kit进行免疫细胞化学法鉴定，并测定生长曲线，观察含药血清（木豆叶）对离体骨髓间充质干细胞（MSC）生长作用的影响。结果：所培养的细胞在表型表达和细胞形态上初步具备MSC特征，木豆叶血清组增长速度比空白对照组明显加快，并与剂量呈正比；证明含药血清能促进干细胞在体外增殖。结论：木豆叶含药血清对MSC有促进生长作用。     

菟丝子含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制

目的:探讨菟丝子含药血清体外对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响及机制研究。方法:分离、培养大鼠MSCs,菟丝子含药血清诱导培养MSCs 72h后,MTT法检测大鼠MSCs增殖情况;RT-PCR检测增殖过程中MSCs不同细胞因子mRNA的表达;Real-time PCR检测骨形态蛋白-2(BMP-2)mRNA表达;Western-blot检测BMP-2蛋白表达。结果:10%菟丝子含药血清具有显著促进MSCs增殖的作用(P<0.05),并显著促进BMP-2 mRNA的表达(P<0.05)。结论:10%菟丝子含药血清促进MSCs增殖的作用,可能与其促进BMP-2 mRNA表达有关。     

龙鳖胶囊含药血清通过调控Hippo-YAP信号通路促进骨髓间充质干细胞迁移研究

目的 探索龙鳖胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)迁移和Hippo-Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)信号通路的影响.方法 通过全骨髓贴壁法提取大鼠原代BMSCs,取第3代细胞,采用流式细胞术检测CD29、CD44、CD...     

接骨散含药血清对骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化影响

目的:研究接骨散含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞(rBMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法:采用高、中、低剂量灌服大鼠制得接骨散含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清;采用贴壁筛选法培养大鼠骨髓间充质干细胞,并以3种不同浓度的含药血清干预第二代rBMSCs。MTT法检测细胞增殖情况;于干预后的第3天、6天、9天和12天分别测定细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、碱性磷酸酶阳性克隆数(CFU-FALP)、钙盐沉积量以及钙化结节数,并比较各组间差异。结果:中剂量接骨散含药血清强烈刺激细胞增殖活性并显著促进骨髓间充质干细胞成骨性分化,表现在该组的ALP活性、CFU-FALP、钙盐沉积量和钙化结节数显著高于对照组(P<0.05)。结论:接骨散含药血清具有促进rBMSCs增殖和成骨性分化活性。     

补肾壮骨颗粒含药血清对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨补肾壮骨颗粒含药血清对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞（ MSCs）体外增殖的影响。方法：选用10只6月龄SD大鼠去卵巢制作骨质疏松模型,对骨质疏松骨髓间充质干细胞进行分离和体外培养,传代后的 MSCs分为OP组、OP＋补肾壮骨颗粒含药血清组和OP＋空白血清组,倒置显微镜观察各组MSCs的生长情况,进行形态学观察,并用四甲基偶氮唑蓝（ MTT）法测定生长曲线。结果：OP＋含药血清组,MSCs呈典型的集落生长,细胞呈长梭形,突起细长且多,细胞增殖较旺盛,细胞数量不断增加,随着传代次数的增多,细胞增殖速度减慢。OP组及OP＋空白血清组MSCs接种后胞体立体感下降,体积较大,细胞偏圆形,突起收缩,增殖速度较慢,细胞数量减少;随着传代次数的增多,细胞增殖速度显著减慢。OP＋补肾壮骨颗粒含药血清组骨髓间充质干细胞增殖能力明显提高,生长曲线有显著性差异。结论：补肾壮骨颗粒含药血清能促进去卵巢骨质疏松大鼠MSCs的增殖。     

五种中药(或方剂)含药血清对体外骨髓间充质干细胞增殖活性影响的筛选研究

目的 筛选观察单味中药黄芪、丹参、仙灵脾、雪莲花及复方右归饮含药物血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养增殖活性的作用.方法 雪莲花乙醇浸泡后定容,其他单味和复方中药水煎定容,高压灭菌.按10倍于任用剂量进行SD大鼠灌胃,心脏采血,制备血清.取大鼠股骨和肱骨,分离骨髓间充质干细胞,常规培养传代3次后,加入含药物血清.药物血清分为15%,10%,5%和1%浓度,作用3 d后用MTT法测定细胞活力.结果 雪莲花及右归饮含药血清在3个浓度组促进细胞增殖(P<0.05).结论 雪莲花含药血清具有促进大鼠骨髓间充质干细胞体外培养增殖活性的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞培养鉴定及复方扶芳藤合剂含药血清对细胞增殖的影响

目的:建立SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养方法,观察不同浓度的复方扶芳藤合剂大鼠含药血清对大鼠BMSCs增殖的影响。方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化BMSCs,对其进行细胞形态学观察,将BMSCs进行成骨、成脂定向诱导分化,采用流式细胞仪检测其表面标志物,分析其细胞周期,进行BMSCs鉴定;采用不同浓度(20%、10%和5%)的复方扶芳藤合剂含药血清和空白血清连续7 d对大鼠BMSCs进行干预,以CCK-8法检测其吸光度值,对比各组细胞生长情况。结果:BMSCs具有典型的成纤维样细胞形态,集落生长呈漩涡状。BMSCs成脂、成骨诱导后,油红O染色和茜素红染色均呈阳性。第3代BMSCs表型CD29、CD44、CD34、CD44表达分别为99.645%、99.677%、0.016%、0.133%;不同浓度的复方扶芳藤合剂含药血清和空白血清连续干预7 d后,CCK-8法检测显示:20%浓度的复方扶芳藤合剂含药血清组,其1～7 d的吸光度均值均高于20%浓度的空白血清组(P<0.05);10%的含药血清组的吸光度均值在3～7 d,高于10%的空白血清组(P<...     

杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化的实验研究

目的 研究补肾中药杜仲含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及定向分化的影响.方法 将第4代MSCs以5×106接种于9块96孔板,3组,每组8孔;2块6孔板,每板3孔,2 d后换液,加入诱导液.分为空白组、地塞米松组、杜仲组.空白组加入含10%胎牛血清(FBS)的 L-DMEM培养基继续培养,地塞米松组在基础培养基加入诱导剂(含β甘油磷酸钠10mmol/L,地塞米松0.1 μmol/L,维生素C 50 mg/L),杜仲组为含10%杜仲含药血清的L-DMEM培养基.分别自加诱导液第1天起,采用MTT法测量96孔板细胞数,每天1块板;在第10天取出1块6孔板做ALP染色;第20天做6孔板茜素红染色.结果 杜仲含药血清组OD值呈现出明显的上升趋势,而空白组和地塞米松组无明显上升趋势;第10天杜仲组及地塞米松组ALP染色阳性,第13天起可见白色钙结节,第20天茜素红染色阳性.结论 杜仲含药血清能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并刺激细胞增殖.     

益气活血方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的：探讨益气与活血中药含药血清对骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs ）增殖能力的影响。方法全细胞贴壁培养法获取、纯化BMSCs,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞的培养体系,采集空白对照大鼠、益气药、活血药、益气活血中药灌胃大鼠含药血清,用10%浓度以上不同含药血清培养第三代BMSCs,置于37℃,5% CO2培养箱中孵育。用流式细胞术鉴定BMSCs。噻唑基四唑比色法（ methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）测细胞活性,绘制生长曲线,观察10%益气、活血、益气活血中药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响。结果采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs,经流式细胞术检测,CD44、CD106呈阳性表达,基本不表达CD45、CD34;MTT法检测结果显示,培养第2、4、5天细胞快速增长,均较前一天增长明显（ P 〈0．05）,第6天时活血方血清组与益气活血方血清组细胞增长已呈下降趋势,而其它三组在第6天细胞增长达最大,与前一天比较仍有差异（ P〈0．05）,到第7天呈下降趋势。 BMSCs去除基线增殖率组间比较,培养第2天时,各组间比较虽无差异,但活血方血清组达最大（71．39±177;4．98%）;第4、6天时,益气活血方组达最大（66．40±177;1．47%）,与其它三组比较P〈0．01,活血方血清组次之;培养第6天时,益气方血清组较其它三组大,益气活血方血清组次之,活血方血清组最低。结论全细胞贴壁培养的大鼠骨髓间充质干细胞在细胞形态与表形表达上均具备BMSCs特征;益气活血中药含药血清对培养BMSCs增殖影响最大,活血方含药血清对细胞增殖影响出现最早、益气方含药血清对细胞增殖影响时间最长。     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

松果菊苷含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨分化及BMP2表达的研究

目的:探讨松果菊苷含药血清促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及可能的机制。方法:大鼠用松果菊苷(16mg/kg)灌胃4天后,取血清备用。采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为8组:空白对照组、松果菊苷含药血清组(2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%)、经典成骨诱导组(10%FBS+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松+50μmol/L维生素C)。ELISA测定碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的表达;免疫荧光细胞化学染色和Western blot检测BMP2蛋白的表达,RT-PCR检测BMP2mRNA的表达。结果:与经典成骨组相比,10%松果菊苷含药血清使BMSCs表达ALP(80.16U/L)和BGP(150.79 U/L)增强,BMP2免疫荧光、BMP2蛋白表达及BMP2mRNA的表达也明显增强。结论:松果菊苷含药血清可以诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,10%松果菊苷含药血清组的效果最佳,其作用机制与BMP2表达增加有关。     

杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究

目的 研究杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs) 向成骨细胞定向分化过程的蛋白表达差异,分析杜仲诱导MSCs向成骨细胞分化的可能调控机制.方法 对杜仲含药血清干预前、干预后第2天、第7天,第14天的细胞提取总蛋白,通过双向电泳分离、PDQuest-7.3.0胶图分析软件进行分析找出差异蛋白,并进行质谱分析、数据库查询建立功能蛋白质组.结果 双向电泳分离得到641个蛋白点,选取其中75个点进行质谱分析,经数据库查询得到6个功能蛋白.结论 实验认为补肾中药杜仲可能通过上调波形蛋白、核纤层蛋白A的表达促进细胞分化,下调钙网织蛋白表达,释放细胞内钙,参与钙结节的形成,与体内骨矿化过程有关.过氧化物歧化酶、膜联蛋白A6与细胞的活力有关,调节着细胞的分裂增殖与分化,但是否与定向成骨细胞分化有着密切关系尚有待进一步研究.     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞SDF-1表达的影响

目的:研究川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞(MMSCs)表达趋化因子SDF-1的影响。方法:收集SD大鼠的股骨、胫骨骨髓内的细胞进行体外培养,取第3代细胞用于实验。用含不同浓度的川芎嗪低糖培养液培养MMSCs,用RT-PCR法检测培养1d、3d、5d、7d MMSCs的SDF-1mRNA的表达。结果:培养1d后,未诱导的MMSCs和5-氮胞苷诱导后SDF-1mRNA均未出现明显表达,但随着培养时间的延长,SDF-1的表达逐渐增强。0.08mmol/L和1.28mmol/L浓度的川芎嗪在干预1d后,MMSCs上的SDF-1已出现表达,干预3d后不同浓度的川芎嗪可明显加快SDF-1的表达,干预第5d和第7天后,0.08mmol/L川芎嗪组促SDF-1的表达作用要高于其他诱导组。结论:川芎嗪可促进大鼠骨髓间充质干细胞SDF-1mRNA表达,有助于促进MMSCs向心梗局部的归巢。     

黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的特性

目的观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响,为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝(MTT)法筛选出黄芪多糖的合适浓度,取F3代细胞,采用随机数字表法分为对照组和诱导组(神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导),采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脂蛋白酯酶(LPL)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示,在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显,甲苯胺蓝染色阳性,而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达,LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞,而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。     

陇中损伤散含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的影响

目的:研究不同浓度的陇中损伤散含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法:取三月龄wistar大鼠骨髓,分离BMSCs进行原代培养,在第一次换液后分别加入2%,5%,10%的陇中损伤散含药血清,通过倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法测量骨髓间充质干细胞增殖情况;偶氮偶合法进行碱性磷酸酶阳性克隆(CFU-FALP)组织化学染色,vonKossa染色法测定钙化结节数目,免疫细胞化学技术检测Ⅰ型胶原表达;于不同时间进行ALP活性及钙盐沉积量的测定。结果:陇中损伤散含药血清对BMSCs的影响呈剂量依赖性,其中以浓度为10%时作用最强。MTT结果显示陇中损伤散含药血清能明显促进BMSCs增殖;损伤散含药血清还能显著促进其成骨性分化。结论::陇中损伤散活性代谢产物能促进BMSCs的增殖和成骨性分化;陇中损伤散对骨髓间充质干细胞的这种作用可能是其促进骨折愈合、防治骨质疏松的细胞学机制之一。