TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

TSG101-siRNA表达载体对结肠癌HT29/L-OHP细胞株耐药的逆转作用

目的 构建TSG101(tumour susceptibility gene101,TSG 101)小干扰RNA(TSGl01-siRNA)的真核表达载体,观察RNA干扰沉默TSG101基因后化疗药物奥沙利铂(L-OHP)对结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP增殖的影响.方法 根据小干扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列,应用DNA重组技术将目的 序列克隆入小干扰RNA的表达载体;RT-PCR检测TSG101.siRNA对HT29/L-OHP细胞TSG101 mRNA表达的影响;Western blot榆测TSGl01-siRNA对TSGl01基因表达蛋白的抑制效率;采用MTT法测定TSGIOI-siRNA联合化疗药物L-OHP对HT29/L-OHP的增殖抑制作用;FCM分析TSG101-siRNA转染HT29/L-OHP细胞前后的细胞周期分布情况.结果 测序显示干扰载体构建成功,TSG101-siRNA能抑制TSG101mRNA表达,使HT29/L-OHP细胞TSG101蛋白的表达下降,明显增强L-OHP对HT29//L-OHP的增殖抑制,TSG101-siRNA转染HT29/L-OHP细胞后G0/G1期和s期细胞数有增加,而G2/M期细胞数有减少.结论 TSG101-siRNA的真核表达载体能有效地抑制HT29/L-OHP细胞的TSG101 mRNA、TSG101蛋白的表达,提高化疗药物奥沙利铂对HT29/L-OHP的抑制率,能逆转结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP对L-OHP的耐药性.     

奥沙利铂对肝癌细胞HuH-7细胞周期的影响

目的探讨奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)对人肝癌细胞株HuH-7细胞周期的影响及其相关机制,为其应用于原发性肝细胞癌临床治疗提供理论依据。方法 MTT方法检测L-OHP对肝癌细胞HuH-7生长的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测L-OHP诱导HuH-7细胞周期阻滞的作用;RT-PCR和Western blot方法观察L-OHP对细胞周期调节因子Cyclin D1、CDK2、CDK4及p16、p21、p53表达的影响。结果 MTT结果显示L-OHP对HuH-7细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势,呈时间剂量依赖性。L-OHP能够诱导HuH-7细胞周期阻滞于S期,并可下调CDK4和Cyclin D1蛋白的表达,上调p21蛋白的表达,低浓度上调p53表达而高浓度下调p53表达,CDK2和p16表达无明显变化。结论 L-OHP可能通过影响CDK4、Cyclin D1及p21的活性使HuH-7细胞阻滞在S期,从而抑制肝癌细胞HuH-7的增殖。     

TSG101-siRNA对肝癌耐药细胞株QGY/CDDP的逆转作用

目的 构建TSG101(tumor susceptibility gene101)小干扰RNA(TSG101-siRNA)的真核表达载体,观察RNA干扰沉默TSG101基因后化疗药物顺铂(CDDP)对肝癌耐药细胞株QGY/CDDP增殖的影响.方法 根据小干扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列,应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体;RT-PCR检测TSG101-siRNA对QGY/CDDP细胞tsg101mRNA表达的影响;Western blot检测TSG101-siRNA对TSG101基因表达蛋白的抑制效率;采用MTT法测定TSG101-siRNA联合化疗药物CDDP对QGY/CDDP的增殖抑制作用.结果 测序显示干扰载体构建成功,TSG101-siRNA能抑制tsg101 mRNA表达,使QGY/CDDP细胞TSG101蛋白的表达下降,抑制QGY/CDDP细胞的增殖,明显增强CDDP对QGY/CDDP的增殖抑制.结论 TSG101-siRNA的真核表达载体能有效地抑制QGY/CDDP细胞的增殖,提高化疗药物CDDP对QGY/CDDP的抑制率,能逆转肝癌耐药细胞株QGY/CDDP对CDDP的耐药性.     

miR-20b促进胃癌细胞增殖研究

目的：探讨miR-20b对胃癌细胞生长影响及其可能的机制。方法 miR-20b mimic和其特异的抑制剂分别转染胃癌MGC803细胞,二甲基四氮唑蓝（MTT）和流式细胞术检测miR-20b mimic和其特异抑制剂在细胞生长和细胞周期上的效应,western blot检测细胞周期因子的表达改变。结果在转染miR-20b后,胃癌细胞生长加快,而细胞周期则加快由G1向S期转换。而在转染miR-20 b抑制剂后,细胞生长能力明显降低,且细胞周期也出现G1/S转换障碍。机制分析显示,在抑制miR-20b表达后,细胞增殖相关因子c-Myc和细胞周期蛋白D1（ Cyclin D1,CCND1）表达减低,而抑癌因子p21和p15表达显著提高。结论 miR-20b作为oncomiRNA,其通过调节细胞周期相关因子的表达影响胃癌细胞增殖。     

CDK2干扰RNA对人肝癌细胞HepG_2细胞周期和增殖的影响

目的:探讨CDK2 siRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞CDK2 mRNA表达及其对HepG2细胞周期和增殖的影响.方法:利用脂质体转染法将特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒PGenesil-1-CDK2导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组PGenesil-1-HK.G418筛选稳定表达细胞株扩增培养.并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM),分别检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA和细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测癌细胞生长增殖率.结果:经1mo的G418筛选得到稳定表达细胞株,与阴性对照组及空白对照组相比,转染组CDK2 mRNA 水平明显下降,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞.结论:RNA干扰技术可明显抑制CDK2基因的表达,引起 HepG2细胞周期阻滞及肿瘤细胞生长抑制作用,为CDK2介导的肿瘤基因沉默疗法提供实验依据.     

半枝莲阻滞人结肠癌细胞周期的机制

目的研究半枝莲氯仿极性部位提取物（ECSB）阻滞人结肠癌细胞周期的机制。方法用ECSB干预结肠癌细胞株HCT-8、SW620,检测其细胞周期相关基因的表达。结果 ECSB干预SW620细胞后,其p16表达上升,PCNA表达下降;ECSB干预HCT-8细胞后,Cyclin D1、CDK2、CDK4表达下降。结论ECSB通过调控细胞周期相关基因的表达,抑制人结肠癌细胞的增殖。     

曲古抑菌素A诱导胃癌细胞细胞周期阻滞及其机制

目的研究去乙酰化酶抑制剂TSA对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的作用及机制。方法利用细胞计数及流式细胞仪检测细胞生长及细胞周期；利用Western blot、基因芯片及实时定量PCR检测TSA对胃癌细胞周期相关基因的表达。结果TSA可诱导胃癌细胞SGC-7901细胞周期阻滞。TSA可增加胃癌细胞SGC-7901之p53，p21，p27等基因的表达，降低CDK2，CCNDl等基因的表达。TSA可通过调控多个细胞周期相关基因的表达阻滞胃癌细胞细胞周期，从而抑制胃癌细胞的生长。结论TSA可通过调控多个细胞周期相关基因诱导胃癌细胞细胞周期阻滞，从而达到其抑制胃癌细胞生长的作用。     

RhoA蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的: 探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制.方法: 构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布.结果: 野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系.与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞Rho A蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调, p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降.结论: 转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑.     

抑制Cyclin D1基因对K562细胞生长和Vp16敏感性的影响

目的 应用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),构建针对细胞周期素D1(Cyclin D1)的RNAi,并检测其对K562细胞增殖和对化疗药物敏感性的影响.方法 采用针对Cyclin D1的RNAi质粒载体转染K562细胞,用反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测Cyclin D1RNAi后mRNA和蛋白水平的表达;用MTT实验测定细胞的增殖;流式细胞术测定细胞周期和凋亡.结果 针对Cyclin D1 RNAi转染白血病K562细胞后,可以明显降低白血病K562细胞中Cyclin D1的mRNA和蛋白的表达,明显抑制K562细胞的增殖,提高化疗药物Vp16诱导的细胞凋亡.结论 利用RNAi抑制Cyclin D1可抑制白血病K562细胞增殖,提高对化疗药物Vp16的敏感性.     

Stat3信号传导通路对结肠癌细胞G1～S期的调控

目的：探讨Stat3信号传导通路对结肠癌细胞G1-S期调控的可能机制。方法：应用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌SW480与HCT116细胞，阻断其Stat3通路；MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期；Western blot检测Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs、p21、p27的表达。结果：转染Stat3反义寡核苷酸后结肠癌细胞增殖受抑制，Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs表达水平下降，p21与p27表达水平上升。结论：Stat3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物与CK1成员之间的平衡而调节结肠癌细胞G1-S期转换。     

Enhanced Chemotherapy Sensitivity of Human Colon Cancer Cells to 5-Fluorouracil by siRNA Recombinant Expression Vector Targeting Survivin Gene

Objective To investigate the effects of small interfering RNA （siRNA） recombinant expression vector targeting survivin gene on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5-fluorouracil. Methods siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell lines LOVO. After 48 hours of transfection, cells were harvested for analysis of survivin mRNA and protein expressions using RT-PCR and Western blot. In addition, after human colon cancer cell lines were treated with Survivin siRNA and/or 5-fluorouracil, MTT assay and flow cytometry were used to analyze cell proliferation and apoptosis. Results Restriction endonuclease analysis confirmed that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was successfully constructed. Inhibitory ratios of survivin mRNA and protein expressions by Survivin siRNA were 36.33% and 44.65%, respectively. Survivin siRNA combined with 5-fluorouracil significantly increased the cell proliferation inhibitory ratio and apoptosis ratio compared with 5-fluorouracil treatin~ alone （P〈0.05）. Conclusion The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene can inhibit the expression of survivin gene, and enhance chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5- fluorouracil.     

靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2等基因表达影响的研究

目的 探讨Cyclin D1表达下调对Mdm2等基因表达及人肝癌细胞增殖的影响.方法 用脂质体将Cyclin D1-siRNA转染人肝癌细胞株Hep3B细胞.实验分为空白对照组、阴性对照siRNA组、Cyclin D1-siRNA组.采用RT-PCR和Western blot检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21表达,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡.结果 与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,Cyclin D1-siRNA组P53和P21表达上调(P＜0.05),Cyclin D1、Mdm2和Mdm4表达下调(P＜0.01);3组细胞周期G1、S及G2期均无明显差异(P＞0.05);Cyclin D1-siRNA组较其他两组细胞活力明显减弱(P＜0.01),细胞凋亡明显增强(P＜0.01).结论 Cyclin D1表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达,并能上调P53和P21的表达;Cyclin D1表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡.     

抑制USP22基因对人结直肠癌细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术探讨泛素特异性肽酶22（USP22）对人结直肠癌细胞增殖的影响。方法 免疫荧光检测结直肠癌组织中USP22的表达;Western blotting检测体外培养的HCT-116、SW480、HC-29结直肠癌细胞株中USP22的表达,筛选出表达量最高的细胞作为研究细胞。设计、合成针对USP22特异性siRNA,同时设置阴性对照siRNA,利用脂质体转染结直肠癌细胞后,Western blotting检测siRNA抑制效率;通过MTT法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞的周期及凋亡;Western blotting检测周期相关蛋白CyclinB1、p21、p53、CDK2的表达。结果 结直肠癌组织中USP22表达量与癌旁组织比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,结直肠癌组织中USP22表达量升高。SW480细胞中USP22的表达量最高,因此作为靶细胞进行后续研究。与对照组比较,USP22 siRNA能够降低USP22的表达（P?<0.05）。USP22抑制后,与对照组比较,能够抑制SW480细胞的增殖,促使SW480细胞停滞于G0/G1期,抑制细胞周期进程,增加细胞凋亡率（P?<0.05）,进而抑制细胞增殖（P?<0.05）;同时,与对照组比较,CyclinB1、CDK2的表达量降低（P?<0.05）,p53和p21的表达量升高（P?<0.05）。结论 USP22抑制后,能够抑制结直肠癌细胞的增殖,其机制可能与抑制细胞周期进程、促进细胞凋亡有关。     

α1,3 FucT-VII基因转染对人结肠癌LOVO细胞的作用

 目的 观察α1,3 FucT-VII基因转染对人LOVO细胞的生物学行为的改变 方法 采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后LOVO细胞中α1,3 FucT-VII基因的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,并通过体外迁移、侵袭实验检测转染前后LOVO细胞运动侵袭能力的变化。 结果 LOVO细胞微弱表达α1,3 FucT-VII,RT-PCR和Western blot方法验证转染后的LOVO/FucT-VII高表达α1,3 FucT-VII。转染后细胞生长增快,S期细胞增多而G1期细胞减少,细胞趋化性迁移和侵袭能力增强。结论 α1,3 FucT-VII基因能改变人结肠癌LOVO细胞的生物学行为,增强细胞趋化性迁移和侵袭等转移表型。     

Bmi-1 siRNA对宫颈癌Hela细胞体外增殖能力的影响

[目的]观察siRNA沉默Bmi-1表达对Hela细胞增殖能力的影响。[方法]构建了表达Bmi-1 siRNA的重组真核表达载体,将其转染入Hela细胞,利用荧光法观察转染效率。用RT-PCR及Western blot方法检测转染后细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表达情况;用MTT比色法、台盼蓝拒染法检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期;用平板克隆形成实验检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞的单细胞增殖能力的影响;应用免疫细胞化学(SP法)及Western blot法检测各组细胞Ki-67及CyclinD1的表达。[结果]将构建好的重组质粒成功转染进入了Hela细胞中且转染效率在90%左右;Bmi-1 siRNA转染Hela细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白表达沉默,Bmi-1表达沉默后抑制Hela细胞增殖并使细胞周期阻滞于G0-G1期,能明显抑制Hela细胞的单细胞增殖能力;同时Ki-67及CyclinD1的表达均明显下降。[结论]siRNA介导的Bmi-1基因的表达沉默能抑制Hela细胞的增殖能力,Bmi-1表达可能与宫颈癌的发生发展相关。     

外源性p16基因对人原发性肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨导入外源性p16cDNA真核表达载体对人原发性肝癌细胞系SMMC- 772 1生物学行为的影响及其分子机制。方法:构建外源性p16基因真核表达载体并转染SMMC- 772 1细胞,经G4 18抗性筛选和扩增,得到稳定的表达株,并经RT -PCR及免疫细胞化学鉴定。通过生长曲线,流式细胞术,免疫细胞化学及Western -Blot等实验方法,对转基因后肿瘤细胞生物学行为及细胞周期调控因子CDK4 ,CyclinD1及pRb进行观察。结果:转染外源性p16基因的SMMC- 772 1细胞有外源性p16基因的整合及表达,细胞生长速度明显减慢,倍增时间明显延长,G1期细胞明显多于转基因前(P <0 .0 5 ) ;免疫细胞化学显示外源性p16表达可下调CDK4及cylinD1的表达(P <0 .0 5 ) ,Western -Blot提示转染外源性p16基因后细胞中磷酸化pRb表达明显降低。结论:外源性p16基因导入人肝癌细胞株SMMC -772 1中可稳定表达并使细胞停滞在G1期,抑制细胞生长,其机制可能为下调CDK4、cyclinD1的表达和抑制pRb磷酸化有关。     

腺病毒介导p27基因转染对离体血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨p27基因转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及其机制。方法通过构建携带p27基因的腺病毒并转染培养大鼠VSMC,增强其p27的表达,以免疫细胞化学方法检测p27蛋白在VSMC上的表达;并用3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入及流式细胞仪等方法检测p27过度表达,对有丝分裂原(血清和大鼠血小板衍化生长因子PDGF-BB)刺激VSMC增殖的影响以及细胞周期依赖性激酶2(CDK2)、细胞增殖核抗原(PCNA)和连接蛋白Cx43表达的变化。结果p27阳性表达率随AdCMV-p27转染VSMC时间延长而不断增加,24h达到峰值(85.81%)。AdCMV-p27转染可显著抑制有丝分裂原刺激引起的G0~G1期细胞减少和3H-TdR掺入量的增加(P<0.05);可抑制PDGF-BB刺激引起的CDK2、PCNA和Cx43蛋白表达阳性率的升高(P<0.05);并使p27蛋白表达阳性率由PDGF-BB刺激后的4.23%上升至33.91%(P<0.01)。结论p27过度表达可抑制有丝分裂原刺激引起的VSMC增殖,其机制与其增强p27表达及抑制CDK2、PCNA和连接蛋白Cx43表达有关。