酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞中HCV 1b NS3结合蛋白基因

目的:应用酵母双杂交技术筛选人胰腺cDNA文库中与HCV 1b亚型非结构蛋白NS3相互作用的结合蛋白的编码基因, 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定实验基础.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定, 纯化后的文库质粒转化酵母菌Y187; 构建诱饵质粒PGBKT7-NS3并转化酵母菌AH109, 在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合, 在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选, 提取蓝色酵母菌落质粒, 电转化大肠埃希菌DH5α后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.结果:成功构建人胰腺cDNA文库和pGBKT7-NS3重组质粒; 将pGBKT7-NS3质粒转化AH109酵母菌株后, 并从人胰腺cDNA文库中筛选出11种与HCV NS3蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCV NS3蛋白结合的胰腺蛋白基因中, 部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒E1结合蛋白基因的筛选

目的 应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白E1相互作用的结合蛋白的编码基因.方法 扩增人胰腺细胞cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y187.诱饵质粒pGBKT7-E1转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序.测序结果进行序列比对.结果筛选出16种与HCV E1蛋白相结合的蛋白基因.结论在筛选出的与HCV E1蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分可能与糖、脂类代谢密切相关.     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒NS4B结合蛋白基因的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白NS4B相互作用的结合蛋白的编码基因。方法扩增人胰腺细胞cDNA文库进行纯化鉴定,并将文库质粒转化酵母菌株Y187。诱饵质粒pGBKT7-NS4B转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp）上筛选阳性菌落。应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-H is/-Ade）和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序。测序结果进行序列比对。结果成功构建人胰腺cDNA文库以及pGBKT7-HCV NS4B重组质粒,筛选出7种与HCV NS4B蛋白相结合的蛋白基因。结论筛选出的与HCV NS4B蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关。     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

酵母双杂交初步筛选与HBeAg结合的胰腺细胞蛋白

目的 应用酵母双杂交技术筛选人类胰腺细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用的结合蛋白。方法 醋酸锂法将诱饵质粒pGBKT7-HBeAg转化酵母菌AH109;同时扩增纯化人胰腺细胞cDNA文库并转化酵母菌株Y187。应用酵母双杂交系统3将二者进行配合,在四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）和X-α-gal上进行双重筛选。提取阳性菌落质粒并电击转化感受态大肠埃希菌DH5α,BglⅡ酶切鉴定及与诱饵质粒的共转化回交实验验证,将阳性克隆测序并在Genbank里进行同源性比对和生物信息学分析。结果 初步筛选出包括顺乌头酸酶在内的13个与HBeAg相互作用的蛋白。 结论 HBeAg可能与胰腺文库蛋白相互作用,与2型糖尿病和肝脏脂肪变性等代谢性疾病密切相关。     

HBsAg诱饵载体的构建、表达及人胰腺cDNA文库的扩增、纯化和转化

目的构建HBsAg诱饵真核表达载体,并在AH109酵母菌中进行表达,同时扩增、纯化、鉴定及转化人胰腺cDNA文库。方法通过PCR扩增HBsAg基因,克隆到pGEM-T载体,测序正确后酶切并连接至表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落,提取重组蛋白,经SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析。扩增、纯化人胰腺cDNA文库并进行酶切鉴定及生物信息学分析,醋酸锂法将其转入Y187酵母菌。结果成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBsAg、SDS-PAGE和Western blot显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达;成功构建人胰腺cDNA文库,其容量为4×109 CFU/L,插入片段大小为0.5～2.0kb,长度不均,重组率为100%。结论成功构建HBsAg真核载体并在AH109酵母菌中表达,同时获得高质量的胰腺cDNA文库并转化入Y187酵母菌,为通过酵母双杂交筛选与HBsAg相互作用蛋白基因奠定了基础。     

应用酵母双杂交技术筛选HERG钾通道相互作用蛋白

目的筛选心肌细胞内哪些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用。方法 (1)通过PCR方法扩增编码心脏herg基因N端的cDNA片段(HERG-NT,aa 1-403)和C端的cDNA片段(HERG-CT,aa 669-1159),分别克隆进入pGBKT7载体,构建pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT诱饵质粒;(2)将被诱饵质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-Gal平板上,以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因;(3)将已被诱饵质粒转化的AH109分别与预转染于Y187的人类心脏cDNA文库进行酵母双杂交,分离阳性克隆中的cDNA,并测序。结果 (1)成功构建诱饵载体pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT,测序结果表明herg-NT和herg-CT都和"GAL4 DNA-BD-C-Myc"在同一读框,没有PCR引起的突变;(2)"诱饵"蛋白HERG-NT和HERG-CT均未能自我激化报告基因Ade2、Mel1和LacZ,弱激活报告基因His3,应用5mmol/L的3-AT可以有效抑制HERG-NT或HERG-CT所引起的组氨酸表达;(4)经过严格筛选后,发现Caveolin-1、FHL2和PTPN12等15种蛋白与HERG-NT存在相互作用,Myotrophin等8种蛋白与HERG-CT相互作用。结论成功应用酵母双杂交技术,以HERG钾通道蛋白的氨基端或羧基端为诱饵蛋白,筛选HERG钾通道的相互作用蛋白(Caveolin-1、FHL2、PTPN12、Myotrophin等),这些蛋白质可能与HERG存在相互作用。     

乙型肝炎病毒核心抗原诱饵载体的构建及酵母表达

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达. 方法 以实验室保存质粒为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增HBcAg基因,克隆到pGEM-T载体.测序正确后酶切并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBcAg,Western blot结果显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBcAg蛋白,为研究HBV合并代谢性疾病的机制奠定了基础.     

应用酵母双杂交技术筛选转录因子MEOX2的相互作用蛋白

目的研究同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2在心肌细胞内与哪些蛋白质存在相互作用。方法应用酵母双杂交技术对人心脏cDNA文库进行筛选。（1）通过PCR方法扩增编码组氨酸／谷氨酸（H／Q）富含区缺失的MEOX2蛋白质（Meox2△HQ）的DNA片断，并克隆进入pGBKT7载体，从而构建“诱饵”质粒pGBKT7-Meox2△HQ；（2）将“诱饵”质粒pGBKT7-Meox2△HQ转化酵母菌AH109，然后从被转化的酵母菌中提取蛋白质，应用抗C-Myc单克隆抗体进行免疫印迹分析，检测“诱饵”蛋白的表达；（3）将被“诱饵”质粒转化的AH109分别涂布于SD／-Trp、SD／-Trp／-His、SD／-Trp／-Ade和SD／-Trp／X-α-GAL平板上，以观察“诱饵”蛋白自我激活报告基因与否；（4）将已被“诱饵”质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交，筛选阳性克隆，分离阳性克隆中的cDNA，并测序。结果Meox2△HQ与pGBKT7中的Gal4 DNA结合域及C-myc在同一读框，并稳定表达融合蛋白“Gal4 DNA结合域．C-myc-Meox2△HQ”，“诱饵”蛋白不会自我激活报告基因，筛选得到11个准阳性克隆。结论同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2可能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用，并参与这些蛋白质表达的调控。     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.