脂肪间充质干细胞分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的 探讨脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMCSs)是否能分化为肾小管上皮细胞,用于急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的治疗.方法 体外分离和培养ADMSCs,用一种携带有荧光素酶和红色荧光蛋白(fluc-mrfp)报告基因的慢病毒转染ADMSCs;构建SD大鼠缺血再灌注诱导的AKI模型,将病毒转染ADMSCs直接从肾实质注射移植2×106细胞量.使用生物发光成像仪(bioluminescence imaging,BLI)示踪移植后的ADMSCs在大鼠体内的分布;免疫荧光染色法检测ADMSCs在体内的分化.结果 ADMSCs高表达CD29、CD90,不表达CD31、CD45、CD34;慢病毒转染后的ADMSCs稳定表达fluc和mrfp报告基因.体内ADMSCs移植后,BLI可以检测到荧光信号一直持续到第14天;免疫荧光结果进一步证实移植的ADMSCs可能分化为肾小管上皮细胞.结论 ADMSCs在体内可以分化为肾小管上皮细胞,为进一步研究ADMSCs治疗AKI提供实验基础.     

不同传代倍数人羊膜来源的间充质干细胞成骨成脂分化平衡的研究

目的比较不同传代倍数的人羊膜来源的间充质干细胞（hAMSCs）的增殖活性以及成骨、成脂的分化能力。方法采用胶原酶和胰蛋白酶法分离人胎盘羊膜来源的MSCs,测定分离细胞的表面分子标志。对第3、5、7、9代hAMSCs绘制细胞生长曲线,分别加入成骨和成脂诱导剂,诱导3W后行茜素红和油红O染色,比较不同传代倍数的hAMSCs成骨染色阳性率和成脂率。结果hAMSCs传代至第9代时仍呈克隆样生长,但细胞增殖活力有下降;在第5代后成骨分化能力下降（P〈0．01）,而传代至第7代后,成脂分化能力才有下降（P〈0．01）。结论hAMSCs在连续传代中能保持MSCs的生长特性,但多向诱导分化能力在不同的传代倍数中有一定差别。     

自体角膜缘干细胞移植联合羊膜遮盖治疗眼表疾病31例

眼部酸烧伤、碱烧伤、热烫伤是临床上常见的眼表伤,轻度眼表伤用药物治疗可痊愈,部分患者留下轻度角膜浑浊。大部分严重的眼表烧伤治疗后会出现大量的新生血管膜遮盖角膜,部分良性结角膜肿瘤可覆盖全部角膜,这些眼表疾病行单纯病灶切除后会出现新生血管膜复发或持续性角膜上皮缺损,难以形成稳定的眼表。为更好地重建眼表,我科于2003-05至2009-12利用自体角膜缘干细胞移植联合羊膜遮盖治疗部分眼表疾病31例,取得了较好效果。     

自体角膜缘干细胞移植与羊膜移植治疗翼状胬肉疗效比较

目的比较自体角膜缘干细胞移植与羊膜移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法将61例(68眼)患者随机分为两组,分别采用角膜缘干细胞移植术[35例(38眼)]和羊膜移植术[26例(30眼)]治疗,术后随访3个月至2年。结果角膜缘干细胞移植组1眼复发,复发率2.63%,羊膜移植组3眼复发,复发率10.00%,两组比较有显著差异(P<0.05)。结论胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植或羊膜移植是治疗翼状胬肉的有效方法、可降低复发率减少术后并发症,自体角膜缘干细胞移植较羊膜移植术后不适症状时间短,复发率低,效果更佳。     

损伤抑制基因Dsup对人胚胎干细胞生物学性质的影响

目的 通过CRISPR/Cas9技术将水熊虫Dsup基因定点敲入胚胎干细胞（hESC-H9）的AAVS1位点,构建Dsup基因过表达的稳定细胞株,研究Dsup表达对hESC-H9生物学性质的影响。方法 构建CRISPR/Cas9 AAVS1位点敲入系统,采用PCR技术扩增Dsup序列,并将其插入pAAVS1-Donor-GFP-Puro,将构建的pAAVS1-Dsup-GFP-Puro与pAAVS1-CRISPR-Cas9载体共同转染hESC-H9,通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组使Dsup基因插入hESC-H9的AAVS1位点,经嘌呤霉素筛选后利用流式分选技术分选GFP、TRA-1-60、SSEA-4等3种荧光标记阳性的细胞群,获得稳定敲入Dsup基因并保持干性的细胞。将获得的hESC-H9-Dsup传至第9代,对Dsup mRNA表达水平、GFP、细胞表面干性标志物（TRA-1-60、SSEA-4）以及干性基因（OCT4、SOX2、NANOG）进行检测,并研究hESC-H9-Dsup的增殖、凋亡以及辐射耐受情况,以探索Dsup基因对hESC-H9生物学活性的影响。结果 ...     

人胚胎干细胞的体外原代培养条件分析

目的 :探讨人胚胎干细胞 (embryonicstemcells,EScells)的体外原代培养条件及相关影响因素。方法 :分别从标本的取材、胰蛋白酶的浓度及消化时间、培养基中白血病抑制因子 (leukemiainhibitoryfactor,LIF)的浓度等方面来观察人ES细胞的原代培养条件 ,并对其进行碱性磷酸酶染色鉴定。结果 :药物流产且胎龄在 5～ 1 0周及人工流产且胎龄小于 5周者 ,其胚胎的完整率较高。采用 0 .1 2 5 %胰蛋白酶室温下消化 3～ 5min ,有较高的克隆形成率。为防止ES细胞过早分化 ,培养基中LIF的浓度应在 5～ 1 0ng·ml- 1 之间。结论 :人ES细胞原代培养的取材应以人工流产且胎龄在 5周以下、及药物流产且胎龄在 5～ 1 0周者为主 ,以 0 .1 2 5 %胰蛋白酶室温下消化胚胎组织 3～ 5min ,培养基中LIF的浓度应在 5～ 1 0ng·ml- 1 之间 ,这样有利于提高ES细胞培养的成功率并抑制其过早分化     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达microRNAs的筛选

目的 筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的microRNAs。方法 用microRNAs芯片筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的microRNAs。结果 与 BEP2D细胞相比,R15H20细胞中存在38个差异表达microRNAs,其中18个表达上调,20个表达下调;与 BEP2D细胞相比,RHT35细胞中存在87个差异表达microRNAs,其中47个表达上调,40个表达下调;与 R15H20细胞相比,RHT35细胞中存在38个差异表达microRNAs,其中20个表达上调,18个表达下调;与 BEP2D细胞相比,R15H20和RHT35细胞中变化一致的microRNAs有25个,其中10个表达上调,15个表达下调。结论 microRNAs表达异常与α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化密切相关。     

人胎盘来源干/祖细胞生物学特性研究进展

胎盘通过分离可得到许多表型可塑性的细胞类型,现已成为再生医学新的细胞来源途径。目前已发表的众多文献使用了不同的分离鉴定方法,描述了来自胎盘不同区域的干细胞。本文系统整理人胎盘来源的各种干/祖细胞的生物学特性,并提示这些细胞在将来临床应用的可能性。     

动物胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(Inner cell mass ICM)或原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)经体外分化抑制培养分离克隆的,ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用。本文介绍了胚胎干细胞的生物学特性,国内外研究进展和研究动态,阐明了建立ES细胞系的技术要点以及ES细胞的应用及发展前景。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

羊水来源多潜能干细胞的培养鉴定及其定向分化能力研究

目的 建立人羊水来源多潜能干细胞的体外培养体系,探讨其生物学特性和定向分化能力.方法 取人孕中期羊水标本进行原代培养,采用贴壁法分离获得干细胞.以流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,并使用特定培养基诱导羊水多潜能干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞分化.结果 体外培养的羊水干细胞呈纺锤形,增长迅速,细胞表达Oct-4、S...     

人气道上皮细胞的体外原代培养研究

目的 探索简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .方法 以人肺叶或肺段支气管为取材对象,用蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并与蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法、胰酶消化 机械刮刷法比较分离的细胞数、纯度及成活率,同时比较含必需营养因子的DMEM/F12无血清培养与有血清培养时的细胞纯度及成活率.角蛋白AE1/AE3免疫组化鉴定培养的细胞.结果 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞数为(9.37±1.62)×105,而蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法组为(5.20±0.75)×105,二者比较差异显著(P＜0.01);蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞成活率及纯度均高于胰酶消化 机械刮刷法组(94.3% vs 85.7%,92.5% vs 83.0%,P＜0.05);无血清培养的成活率及纯度均高于有血清培养(90.7% vs 82.1%,95.5%vs 83.0%,P＜0.01);培养的细胞角蛋白AE1/AE3染色阳性.结论 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并用含营养因子的DMEM/F12无血清培养是一种简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

人诱导多能干细胞体外多向分化能力的方法验证

 目的 探讨人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)体外多向分化能力的方法。方法 iPSC通过形成拟胚体(embryonic body, EB)的阶段,将其诱导为间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)样细胞,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化,流式细胞术检测iPSC来源的MSCs(iPS-MSCs)表面标志物的表达,并进一步将iPSC-MSC诱导为成骨、软骨细胞;或直接EB接种,将其诱导成神经细胞。通过上述方法验证iPSC的多向分化能力。结果 诱导后的 iPSC-MSC 逐渐向外生长变为长梭形; CD29、CD105在 iPSC -MSCs 中表达阳性, 而 CD34、CD45则为阴性; 碱性磷酸酶、甲苯氨兰染色结果表明iPSC -MSCs 具有成骨、成软骨的能力;iPSC亦可直接从EB阶段诱导成神经细胞。结论 通过上述方法,可成功诱导iPSC 为成骨、成软骨、成神经细胞,为 iPSC进一步的研究与应用提供了技术基础。     

人羊水来源MSC的分离培养鉴定及其免疫抑制特性的初步研究

目的：体外分离培养鉴定具有间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法：贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导分化为脂肪样细胞、成骨样细胞等方法进行鉴定后,以细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）体外检测人羊水来源间充质干细胞（amniotic fluid derived-mesenchymal stem cells,AFMSC）对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,并对其时效、量效关系进行分析。结果：具备MSC形态、表型及分化潜能特征的人羊水来源细胞,可于体外显著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖（P〈0．05）,时效、量效关系显著（P〈0．05）。结论：从免疫抑制特性角度证明羊水可成为替代骨髓的MSC新来源。     

肿瘤微环境中间充质干细胞的相关生物学特性分析

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在肿瘤微环境中是否获得肿瘤细胞的相关生物学特性而导致恶性转化。方法通过6孔板结合Transwell小室建立间充质干细胞和大鼠C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,另设单独培养的间充质干细胞作为对照组。于相差显微镜下观察培养后两组细胞的形态学改变;采用流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化;采用荧光定量PCR和免疫荧光法检测间充质干细胞mdm2、p53mRNA水平及共培养后两组细胞中p53突变蛋白和mdm2癌蛋白的表达。结果共培养后实验组细胞表现为胶质瘤细胞样形态。细胞周期检测结果显示共培养7d后,对照组G1期细胞占90.48%±6.62%,实验组占82.22%±2.74%,两组间差异无统计学意义(P>0.05);对照组S期细胞占4.66%±4.16%,实验组占7.35%±1.93%,两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。定量PCR及免疫荧光检测显示,实验组p53mRNA水平明显降低,为对照组的0.24倍(P<0.05);部分实验组细胞(24.8%)中表达突变型p53蛋白,而对照组无突变p53蛋白表达(P<0.05)。实验组mdm2mRNA及其蛋白的表达水平...     

不同来源的间充质干细胞生物学特性差异研究进展

各种来源的问充质干细胞（MSC）除满足国际细胞治疗协会（ISCT）规定的要求外,在表面标记物、增殖、分化、迁移、生物学功能方面有其差异性,骨髓MSC研究最早,最为透彻,但其增殖效率低,易被污染等劣势限制了其应用;脂肪、脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSC取材方便,传代能力强,免疫反应低,被污染的概率较小,无伦理学限制等优点逐渐被人们重视,且利用不同MSC的优劣势将其应用于不同的领域。笔者通过查阅国内外相关文献,从细胞表面标记物,增殖、分化、迁移能力,以及功能方面进行分析总结,初步探讨了各种来源的间充质干细胞的优缺点．为今后临床选取合适弹摁的种子细晌提供帮助。     

悬滴培养对人脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨悬滴培养对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)成骨诱导分化的影响。方法利用酶消化法分离培养hADSCs,采用流式细胞术检测其表面标志的表达。对hADSCs进行悬滴培养,贴壁后添加诱导剂对其进行成骨诱导分化,以平板培养组为对照,诱导分化7d及21d时,利用RT-PCR检测成骨基因Runx2及Osteopontin的表达。结果分离培养的hADSCs表达干细胞表面标志CD44、CD90、CD105,不表达CD34、CD45;悬滴培养3d的hADSCs可形成大小均一的球状三维结构;RT-PCR结果表明,在成骨诱导分化的不同时间点,hADSCs悬滴培养组的成骨基因Runx2及Osteopontin表达均比平板培养组高,表明悬滴培养可促进hADSCs的成骨诱导分化。结论悬滴培养有利于hADSCs的成骨诱导分化,有助于提高其成骨诱导效率。     

人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)理想的分离、培养方法。方法采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养人骨髓干细胞,并将其分别置于普通培养瓶6、0Co培养瓶中培养,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间充质干细胞;流式细胞术检测细胞表面标志。结果人骨髓干细胞呈均一梭形、成纤维细胞样,形成集落样生长。60Co培养瓶细胞贴壁情况明显好于普通培养瓶,且费用低;免疫组化及流式细胞术显示CD34、CD45表达为阴性,CD29、CD44表达为阳性。60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养简单易行,骨髓干细胞增殖快,活性好,传代力持久。可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究与临床应用提供了实验方法及依据。