小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆

克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。方法：设计引物,以小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库为模板,利用ＰＣＲ方法,扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ－１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ｔｕｆｔｅｌｉｎ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉丛蛋白成熟编码区基因     

过量氟对大鼠切牙釉丛蛋白表达的影响

目的研究过量氟对大鼠切牙发育过程中釉丛蛋白表达的影响,探讨氟斑牙的发病机制。方法选择20只Wistar大鼠,随机分成两组:对照组(蒸馏水组)和实验组(100mg/LF-)。复制大鼠氟斑牙模型。饲养8周处死动物,利用免疫组化和实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)方法观察过量氟对大鼠切牙中釉丛蛋白表达的影响。结果免疫组化结果显示釉丛蛋白在分泌前期和分泌期的成釉细胞中呈阳性表达。实验组釉丛蛋白的表达明显弱于对照组,存在显著性差异(P<0.01)。Real-TimePCR结果显示釉丛蛋白mRNA在对照组表达明显高于在实验组表达水平(P<0.01)。结论过量氟可能通过抑制釉丛蛋白的表达,从而影响釉质的矿化,导致釉质发育障碍。     

小鼠成釉蛋白基因cDNA全序列的克隆

目的 筛选与小鼠牙胚发育相关的特异基因。方法 利用随机引物、反转录酶合成特异和非特异探针，采用差异显示方法筛选小鼠牙胚cDNA文库，挑选阳性克隆并测序。结果 得到6个阳性克隆，经测序证实其中1个克隆序列与大鼠成釉蛋白序列高度同源：其中用pTriplEX 3′引物测得的526个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因5′端的32－580序列有497个碱基一致，5′引物测得的567个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因3′端的1285－1854序列有533个碱基一致。结论 筛选到小鼠釉基质特异蛋白－成釉蛋白基因的cDNA全序列。     

出生后大鼠牙胚组织中nfic基因多种选择性剪接体的克隆研究

目的:研究nfic基因在牙齿发育中的作用。方法:提取出生后SD大鼠磨牙牙胚组织总mRNA, 反转录合成cDNA。根据NCBIGeneBank中nficcDNA序列,分别设计2对PCR引物,进行nfic基因部分序列的扩增,扩增产物与T载体进行T/A连接,然后转化高效感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行酶切鉴定,并对扩增产物进行序列测定。结果:P1、P2为引物进行PCR扩增,可见大小约350bp的特异扩增产物;以P3、P4为引物进行PCR扩增,电泳可见大小不同的3条特异扩增产物,经克隆后的序列测定,为大鼠nfic基因的3种可变剪接体。结论:nfic基因在大鼠牙齿发育后期、牙根的发育前期有表达,并且存在至少3种大鼠nfic基因选择性剪接体。     

釉质基质特异蛋白--釉丛蛋白

釉基质蛋白是近年来的研究热点。釉从蛋白是成釉细胞合成分泌的釉基质特异蛋白，主要分布于釉牙本质界，为磷酸化的酸性蛋白，能够螯合钙离子，在釉质形成中发挥启动矿化的作用。     

小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

目的：克隆小鼠成釉蛋白（ＡＭＢＮ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段（约１．１ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＴＺ１８质粒载体,转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＴＺ－ＡＭＢＮ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠成釉蛋白成熟肽编码区基因     

成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位

目的：观察成釉蛋白（ameloblastin,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况。方法：采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位。结果：蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达；出生后1d钟状期，在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达，成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达；出生后3d，在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达，在成牙本质细胞中表达阳性，着色较成釉细胞深；出生后7d，AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达，其余部位呈阴性表达。在牙胚发育的各个时期，AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论：AMBN参与釉基质的形成，可能与牙胚发育中基质形成的信息传递有关。     

小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠釉原蛋白（ＡＭＧ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段（约６７０ｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＡＭＧ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。     

牙本质涎蛋白转基因小鼠的构建

目的 构建小鼠牙本质涎蛋白（DSP）转基因小鼠。方法 将pcDNA3．1载体中的CMV启动子替换为启动子cβ-actin，构建戴体pcDNA3．1-Cx。然后将PCR获得的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3．1-Cx中。构建DSP转基因戴体peDNA3．1-Cx-dsp；将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核，受精卵移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，用PCR及Southernblot检测阳性小鼠。结果 共移植717枚注射过的受精卵至29只受体鼠，移卵后产仔67只，阳性4只。阳性鼠分别传代。开始建系。结论 通过显微注射的方法成功获得了DSP转基因小鼠。     

上游刺激因子1在小鼠牙齿发育过程中表达的原位杂交研究

目的：检测小鼠牙齿发育中上游刺激因子1mRNA的表达及时空分布模式。方法：制备E13,16,19,P1,5,8,11,21d小鼠第一磨牙石蜡切片,用我们前期实验制备的USF1cDNA探针,原位杂交方法检测USF1mRNA的表达和分布。结果：原位杂交染色从钟状晚期小鼠牙胚中开始检测到阳性信号,持续至P11d,阳性信号主要定位于成牙本质细胞与成釉细胞;而蕾状期,帽状期,钟状期牙胚中未检测到阳性信号,并且在牙齿萌出后（P21d）,牙齿中USF1mRNA阳性信号再次消失。结论：牙胚中有USF1mRNA表达,主要位于分泌期的成牙本质细胞和成釉细胞,表达模式具有显著的时空特异性。     

小鼠Dlx-5 cDNA的克隆及序列测定

目的 :扩增小鼠Dlx 5的特异性片段 ,构建重组质粒并进行序列测定 ,为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法 :提取E14d小鼠的下颌弓组织总RNA ,以反转录cDNA为模板进行PCR反应 ,克隆Dlx 5至PMD 18T载体上并测序。结果 :从胎鼠下颌弓组织中克隆到Dlx 5基因片段约 869bp ,重组质粒经酶切显示获得正确重组子 ,测序结果与已知序列吻合。结论 :成功地从小鼠下颌弓中克隆到了Dlx 5基因 ,提示胎鼠的下颌弓组织中有Dlx 5基因的表达。     

小鼠核心结合因子1成熟肽编码区的cDNA克隆和序列测定

目的：研究核心结合因子1（cbfal)在小鼠牙胚组织中的表达，扩增cbfal成熟肽编码区的特异性片段，构建重组质粒，为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法：提取新生小鼠的颅骨、牙胚、肝脏组织总RNA，反转录为cDNA后进行PCR反应，构建pGEM-cbfal重组质粒并测序。结果：从小鼠颅骨和牙胚组织中均获得了约1791bp的目的片段，牙胚来源的PCR产物的测序结果证实成功地克隆到了cbfal成熟肽编码区，酶切结果显示重组质粒构建成功。结论：新生小鼠的牙胚组织中有cbfal基因的表达。     

小鼠牙本质磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质磷蛋白（ＤＰＰ）ｃＤＮＡ。方法：用异硫氰酸胍一步法从小鼠牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用ｏｌｉｇｏ（ｄｔ） 作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ 方法,从ｃＤＮＡ 中扩增出小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ基因片段（ 约１ ．６ｋｂ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１ － Ｂｌｕｅ 后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ 基因片段。     

小鼠PeriostinC端编码区cDNA克隆及其序列分析

目的：从小鼠牙周膜组织中克隆PerostinC末端编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明成年小鼠牙周膜组织中抽提总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成cDNA,然后利用PCR技术,从cDNA中扩增出小鼠PeriostinC末端编码区的基因自然（约940bp）,将所得基因片段插入p RSET-B载体,转化大肠杆菌DH5α后随机挑选数个克隆,提取质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pRSET-B-Periostin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠该蛋白C端编码区基因。     

小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子的克隆和序列分析

目的 :获得小鼠牙本质涎磷蛋白 (DSPP)编码序列上游约 1.6kb的特异性启动子。方法 :按Mac Dougall报道设计一对引物 ,提取小鼠胚胎干细胞基因组DNA作为模板 ,PCR获得大小约为 1.6kb的DNA片段 ,将该片段克隆并进行序列分析。结果 :所得到的片段是DSPP的特异性启动子 ,其序列与文献报道有一定差异 ,但转录因子的结合位点均未发生突变。结论 :成功获得小鼠DSPP的特异性启动子 ,为进一步的研究打下基础。     

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶成熟肽编码区cDNA的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶（EMSP）成熟肽编码区的基因。方法：设计引物,以小鼠牙胚总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出小鼠EMSP的基因片段,将所得基因片段插入pBS质粒载体。转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-EMSP的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠EMSP成熟肽编码区基因。