电刺激对2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞葡萄糖运载体4转位及相关信号蛋白的影响

目的观察电刺激对2型糖尿病大鼠（OLETF)骨骼肌细胞葡萄糖运载体4（GLUT4）转位及相关信号蛋白的影响，探讨电刺激诱导的骨骼肌收缩促进OLETF大鼠骨骼肌细胞GLUT4转位的细胞内信号转导机制。 方法取20只OLETF大鼠，分离趾长伸肌，按照抑制剂和电刺激干预的不同分为6组，每组6~8个骨骼肌样本，用Western Blot法测定骨骼肌中蛋白激酶B（protein kinase  B, PKB/Akt）、腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)、细胞外信号调节激酶（ERK）的表达和活性变化，用免疫荧光方法观察GLUT4在细胞膜及细胞内膜的分布。 结果①电刺激诱导OLETF大鼠骨骼肌收缩后，其细胞膜上GLUT4的分布明显增加。②与无电刺激组相比，电刺激组OLETF大鼠骨骼肌细胞Akt、AMPK蛋白活性明显增加（P<0.01）；而ERK蛋白活性无明显改变(P&rt;0.05)。③抑制AMPK信号通路后，电刺激组OLETF大鼠骨骼肌细胞Akt蛋白活性较无电刺激组明显增加（P<0.01）；抑制PI3K信号通路后，电刺激组OLETF大鼠骨骼肌细胞AMPK蛋白活性较无电刺激组明显增加（P<0.01）。 结论电刺激诱导的骨骼肌收缩可促进GLUT4转位至细胞膜，这一过程是通过AMPK和/或PI3K信号转导通路实现的，仅抑制其中一条信号转导通路不能阻止GLUT4的转位。     

胰岛素急性刺激对 PI3K／Akt 和 ERK 通路的分子调节作用

【目的】研究胰岛素（insulin）急性刺激对PI3K/Akt和ERK信号的调节作用及其意义。【方法】HepG2细胞、6只8周龄BALB/C雄性小鼠分别都给予急性胰岛素刺激和磷酸盐缓冲液（PBS）刺激,细胞提取总蛋白、小鼠提取肝组织总蛋白用 Western blotting 法分析 Akt磷酸化水平和 ERK 磷酸化水平,并用免疫沉淀法检测TERT磷酸化水平。【结果】胰岛素急性刺激组 HepG2细胞和肝组织p-Akt、p-ERK水平均较PBS组上调,抑制PI3K/Akt信号通路后 TERT 活性下降。【结论】胰岛素急性刺激可以激活 PI3K/Akt和 ERK信号通路,抑制PI3K/Akt通路可减弱端粒酶活性,这可能为临床肝癌的诊断与治疗提供依据。     

微电场对胎盘滋养细胞迁移/侵袭相关信号通路活性的影响

目的探讨滋养细胞迁移/侵袭相关促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MAPK/ERK),磷酸肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)和蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子3(JAK/STAT3)信号传导通路在微电场刺激下的活化水平。方法将胎盘滋养细胞用场强为150mV/mm的直流微电场加以刺激,通过蛋白质印迹法(Western blot)测定电刺激前和后各时间点滋养细胞MAPK/ERK、PI3K/Akt和JAK/STAT3信号传导通路相关活性分子的活化水平。滋养细胞在加电前分别用MAPK抑制剂PD980599(100μmol/L)和Akt抑制剂LY294002(20μmol/L)处理1h,在上述相应含抑制剂的培养基中用场强为150mV/mm直流微电场刺激5h,观察抑制剂对微电场刺激细胞行为的影响。结果 Western blot结果显示,滋养细胞在150mV/mm微电场作用下,p42/44MAPK Thr202/Thr204位点、Akt Ser473位点于5min开始活化,10~60min内逐渐加强,STAT3S727位点在微电场作用下上述各时间点无明显磷酸化水平改变。相应信号通路抑制剂处理后滋养细胞对微电场刺激的应答反应均受到明显抑制。结论微电场对滋养细胞迁移/侵袭功能的影响与MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路的活化有关。     

高糖对RF/6A细胞内PI3K-Akt信号通路的影响

目的 探讨高糖对视网膜血管内皮细胞内血管新生关键信号通路PI3K-Akt信号通路的影响.方法 以猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞为研究对象,分为空白对照组、甘露醇对照组、高糖组和PI3K-Akt信号通路特异性阻断剂LY294002组,分别采用MTs法检测RF/6A细胞增殖、划痕实验检测细胞迁移以及Mmrigel法检测细胞管腔形成能力,Western blot法检测PI3K-Akt信号通路中关键蛋白Akt的表达以及磷酸化.结果 与空白对照组相比,甘露醇对照组细胞增殖率、迁移率、管腔形成数以及细胞内Akt及P-Akt的表达无统计学差异(P>0.05);高糖组细胞增殖增加15.12%(P<0.05),细胞迁移增加39.24%(P<0.01),管腔形成数增加59 10%(P<0.01),细胞内Akt及p-Akt的表达分别增加27.34%(P<0.05)、25.23%(P<0.05);LY294002组细胞增殖减少17.56%(P<0.05),细胞迁移减少45 71%(P<0.01),管腔形成减少39.08%(P<0.01),Akt及p-Akt的表达量分别减少37.78%(P<0.01)、42.08%(P<0.01);与高糖组相比,LY294002组细胞增殖减少29.06%(P<0.05),细胞迁移减少61.01%(P<0.01),管腔形成减少62.14%(P<0.01);Akt及p-Akt的表达分别减少51.15%(P<0.01)、53.75%(P<0.01).结论 高糖可经上调RF/6A细胞内PI3K-Akt信号通路促进血管新生,PI3K-Akt信号通路阻断剂可拮抗高糖的促RF/6A细胞血管新生的作用.     

SARI过表达对CBFL细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨SARI基因过表达对核结合因子白血病(CBFL)细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法:通过17号外显子测序验证CBFL细胞模型Kasumi-1细胞负载c-KIT N822K突变。构建SARI基因过表达慢病毒载体,并转染Kasuimi-1细胞。采用荧光定量PCR和Western blot鉴定细胞转染后SARI基因过表达效果。设置空白对照(CON)、空载体对照(NC)和SARI过表达(OE) 3组。MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Cyto C、Caspase 9、Caspase 3、cleaved-Caspase 3、PARP、cleavedPARP,以及PI3K/Akt通路蛋白PI3K(p85)、p-PI3K(p85)、Akt、p-Akt的表达变化。结果:Kasumi-1细胞具有c-KIT N822K突变。成功构建稳定过表达SARI基因的Kasumi-1细胞。与NC组细胞相比,OE组细胞增殖减缓,凋亡增加;抗凋亡蛋白BCL-2表达降低,促凋亡蛋白BAX表达增高;出现Cyto C蛋白的表达; Caspase 9、Caspase 3表达降低,cleaved-Caspase3表达增高; PARP表达降低,活性剪切体cleaved-PARP表达增高,PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt磷酸化水平下调(P 0. 05)。结论:SARI基因过表达可通过线粒体途径诱导CBFL细胞凋亡,机制可能与PI3K/Akt信号通路失活有关。     

LY294002对Jeko-1细胞的增殖抑制及作用机制研究

本研究旨在探讨磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/Akt）特异性抑制剂LY294002对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞生长、细胞凋亡的影响及其作用机制.四甲基偶氮唑盐（MTT）方法检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测凋亡相关蛋白Cyclin D1、Bcl-2、procaspase-3及PI3 K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的变化.结果表明,LY294002能抑制Jeko-1细胞的增殖.Jeko-1细胞经LY294002 0、5、10和20 μmol/L作用24 h后,凋亡率分别为（3.25±1.27）％、（11.34±2.35）％、（22.81±2.74）％和（43.61±3.48）％,差异有统计学意义（P＜0.01）;Westem blot检测发现,凋亡相关蛋白Cyclin D1、Bcl-2、procaspase-3表达下降,PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平降低.结论：LY294002可明显抑制Jeko-1细胞增殖,其机制可能通过下调PI3K/Akt信号通路中的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平,抑制PI3K/Akt信号通路,促进细胞凋亡.     

EGFR/PI3K/Akt细胞信号传导通路与肿瘤

表皮生长因子受体(EGFR)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB,也称Akt)信号通路是生物体内一条非常重要的生存信号通路。EGFR通过二聚化后刺激Ras蛋白,导致磷酸化级联反应的发生来激活PI3K/Akt信号通路,从而引起肿瘤的发生发展。本文从EGFR/PI3K/Akt信号传导通路对肿瘤的调节机制等多个方面综述了EGFR/PI3K/Akt信号通路与肿瘤的关系。     

运动训练对脑缺血大鼠PI3/Akt抗凋亡信号转导通路的影响

目的观察运动训练对脑缺血大鼠磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）抗凋亡信号转导通路的影响，探讨运动训练促进脑缺血后神经功能恢复可能的信号通路。 方法成年雄性SD大鼠24只，随机分成运动组、对照组和假手术组，每组8只。用大脑中动脉闭塞法造模24 h后，运动组给予Treadmill跑台训练，每天30 min，连续训练2周，对照组及假手术组不进行运动干预。采用Western blot方法定量检测PI3K/Akt通路的磷酸化水平，并定量测定凋亡相关蛋白Bax的表达。 结果2周后，运动组PI3K/Akt通路中p-PI3K、p-Akt的磷酸化水平明显高于对照组（P＜0.05），而凋亡相关蛋白Bax的表达则明显低于对照组（P＜0.05）。 结论运动训练能促进脑缺血大鼠神经功能恢复，这种改变可能与PI3K/Akt抗凋亡通路激活增加有关。     

普伐他汀对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的:探讨普伐他汀干预对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)凋亡的影响及其相关细胞信号传导通路。方法:应用普伐他汀干预体外培养的第6代人MSCs,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测作用前后ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt通路蛋白的表达及磷酸化情况。将10μmol/L普伐他汀预处理人MSCs 1 h后,换用含1 mmol/L H2O2的完全培养基培养1 h,观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;进一步在普伐他汀干预前用特异的细胞信号通路抑制剂或激动剂阻断或激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt途径,观察其对普伐他汀作用的影响。结果:普伐他汀可使人MSCs的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,使p38MAPK通路磷酸化水平降低,而其对人MSCs的ERK1/2通路和总Akt、总p38MAPK蛋白水平无显著影响。普伐他汀能抑制H2O2诱导的人MSCs的凋亡(P<0.05),PI3K/Akt通路特异抑制剂Ly294002预处理后这种作用消失,p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理对这种作用影响不显著。结论:普伐他汀可激活人MSCs的PI3K/Akt通路,抑制p38MAPK通路,并可抑制H2O2诱导的人MSCs凋亡。PI3K/Akt通路的激活参与了其抗凋亡作用的调控。     

电针对缺氧缺血性脑损伤大鼠海马神经元自噬及IGF-1/PI3K/Akt通路的影响

目的 探讨电针对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠海马神经元自噬及胰岛素样生长因子1(IGF-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的影响。方法 将108只新生大鼠随机分为假手术组、模型组、IGF-1组(0.2 mg/kg)、电针组、电针联合LY294002组(电针+PI3K抑制剂0.3 mg/kg),每组18只。采用左颈总动脉结扎和低氧处理2 h的方法构建新生大鼠HIBD模型(造模成功率为80%)。各组大鼠在手术清醒后和电针治疗结束后进行神经功能缺陷评分;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测脑组织IGF-1的含量;苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织病理学变化;透射电镜观察细胞自噬情况;免疫荧光双标法检测自噬标志物与神经元特异性核蛋白(NeuN)的共定位表达;Western blot法检测海马组织PI3K/Akt通路、自噬相关蛋白的表达[PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化p-Akt(p-Akt)、Beclin-1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3-Ⅰ)]。结果 与假手术组相比,HIBD模型组大鼠海马中神经元损伤...     

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与缺氧诱导因子-1α在急性胰腺炎大鼠的表达调节

目的 探讨急性胰腺炎(AP)大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路与HIF-1α表达的关系.方法 56只雄性SD大鼠随机分为7组:空白对照组(n=8)、假手术组(n=8)、AP模型组(n=8)、wortmannin预处理组(n=8)、rapamycin预处理组(n=8)、wortmannin+rapamycin预处理组(n=8)和溶剂对照组(n=8).用逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制备大鼠AP模型,wortmannin预处理组、rapamycin预处理组、wortmannin+rapamycin预处理组分别于AP模型复制前30 min腹腔注射wortmannin、rapamycin、wortmannin+rapamycin DMSO/PBS溶液,溶剂对照组仅注射DMSO/PBS溶液.模型复制成功后6 h处死大鼠取胰头部胰腺组织,应用Western blot检测HIF-1α、Akt、p-Akt、p70~(s6k)、p-p70~(s6k)蛋白的表达.结果 Akt、p70~(s6k)蛋白在胰腺组织中表达稳定,各组间差异无统计学意义(P>0.05),HIF-1α、p-Akt、p-p70~(s6k)蛋白在空白对照组和假手术组中均有极少量阳性表达,两组间差异无统计学意义(P>0.05).AP模型组HIF-1α、p-Akt、p-p70~(s6k)蛋白含量与空白对照组相比明显升高(P<0.01);wortmannin预处理组、rapamycin预处理组、wortmannin+rapamycin预处理组中HIF-1α、p-p70~(s6k)蛋白表达明显高于空白对照组(P<0.01),但较AP模型组明显降低(P<0.01),其中HIF-1α蛋白表达在wortmannin+rapamycin预处理组比wortmannin预处理组、rapamycin预处理组降低更明显(P<0.05).HIF-1α、p-Akt、p-p70~(s6k)蛋白含量在溶剂对照组和AP模型组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂wortmannin、rapamycin能够显著降低急性胰腺炎大鼠HIF-1α的表达,PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了HIF-1α的表达调控,PI3K/Akt/mTOR信号通路可作为AP防治中的新靶点.     

重组人促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞的迁移及黏附☆

背景:促红细胞生成素可促进内皮祖细胞的增殖分化并增强其黏附性。目的:观察重组人促红细胞生成素干预对人骨髓间充质干细胞迁移和黏附能力及相关细胞信号传导通路的影响。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,使用重组人促红细胞生成素干预第6代人骨髓间充质干细胞。分别用PI3K/Akt通路特异抑制剂Ly294002或p38MAPK通路特异激动剂anisomycin或ERK1/2通路特异抑制剂U0126预处理。结果与结论:重组人促红细胞生成素可使人骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,抑制p38MAPK通路磷酸化水平,对人骨髓间充质干细胞的ERK通路和总Akt、总p38MAPK水平无明显影响。重组人促红细胞生成素作用组中迁移细胞数目显著高于对照组(P<0.01),黏附细胞数亦明显增加(P<0.01),PI3K/AKT通路特异抑制剂Ly294002预处理后重组人促红细胞生成素对迁移能力的作用消失,p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理对两种作用影响均不明显。提示重组人促红细胞生成素具有增强人骨髓间充质干细胞迁移和黏附能力的作用,其增强迁移能力的作用与激活人骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt通路有关,但是它对黏附能力的作用与PI3K/Akt和p38MAPK通路均无关。     

雌激素提高去卵巢大鼠海马CA4区ERK1/2的磷酸化水平

目的研究雌激素对去卵巢大鼠海马CA4区神经元细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）磷酸化水平的影响。方法成年Wistar雌性大鼠随机分为正常对照组（INT）、去卵巢组（OVX）和去卵巢加雌激素组（OVX＋estrogen）。用放射免疫分析方法测定血中雌二醇含量，用免疫组化检测ERK1／2的磷酸化水平。结果去卵巢组大鼠体内雌激素水平明显降低，与对照组和加雌激素组比较均有显著性差异（P〈0．001）；采用免疫组织化学定位检测，显示磷酸化ERK1／2主要表达在神经元胞核和胞质；免疫组化阳性细胞统计分析显示：去卵巢组大鼠海马CA4区神经元胞核和胞质着色浅，ERK1／2磷酸化水平降低，其阳性细胞计数明显减少，与对照组比较有显著性差异（P〈0．001）；去卵巢加雌激素组与去卵巢组相比，海马CA4区神经元胞核和胞质染色深，磷酸化ERK1／2表达阳性神经元增多（P〈0．001），但仍明显低于对照组。结论雌激素提高衰老雌性大鼠脑内ERK1／2磷酸化水平，提示雌激素可通过对衰老状态下ERK信号通路的调节作用达到改善学习和记忆的目的。     

黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

背景：前期研究证实黄芪通过P38MAPK通路促进内皮祖细胞增殖,其影响是否通过PI3K/Akt/eNOS途径实现？目的：观察黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶表达的影响。方法：采用密度梯度离心法获取糖尿病患者外周血单个核细胞,培养7d后鉴定内皮祖细胞。观察0,50,200,800,3200,6400mg/L黄芪多糖分别干预6,12,24,48h对内皮祖细胞影响的量效和时效关系;用黄芪多糖及黄芪多糖与PI3K抑制剂LY294002联合干预糖尿病患者内皮祖细胞,Western blot检测磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达水平。以未进行任何处理健康人内皮祖细胞作为对照组。结果与结论：糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力较对照组明显下降（P〈0.05）。黄芪多糖显著增加糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力,当黄芪多糖在200～800mg/L质量浓度范围,干预6～24h可呈时间及剂量依赖性增强内皮祖细胞的增殖能力（P〈0.01）,并呈剂量依赖性升高内皮祖细胞磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达（P〈0.05）;PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖诱导的Akt、内皮型一氧化氮合酶的磷酸化（P〈0.05）。说明黄芪多糖通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路促进内皮祖细胞增殖和向内皮细胞的分化。     

Differential modulation of brainstem phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling underlies WIN55,212-2 centrally mediated pressor response in conscious rats

Our recent study demonstrated that central cannabinoid receptor 1 (CB?R) activation caused dose-related pressor response in conscious rats, and reported studies implicated the brainstem phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt-extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) pathway in blood pressure control. Therefore, in this study, we tested the hypothesis that the modulation of brainstem PI3K/Akt-ERK1/2 signaling plays a critical role in the central CB(1)R-mediated pressor response. In conscious freely moving rats, the pressor response elicited by intracisternal (i.c.) (R)-(+)-[2,3-dihydro-5-methyl-3[(4-morpholinyl)methyl]pyrrolo[1,2,3-de]-1,4-benzoxazinyl]-(1-naphthalenyl) methanone mesylate salt (WIN55,212-2) (15 μg) was associated with significant increases in ERK1/2 phosphorylation in the rostral ventrolateral medulla (RVLM) and the nucleus tractus solitarius (NTS). In contrast, Akt phosphorylation was significantly reduced in the same neuronal pools. Pretreatment with the selective CB?R antagonist N-(piperidin-1-yl)-5-(4-iodophenyl)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamide (AM251) (30 μg i.c.) attenuated the neurochemical responses elicited by central CB?R activation. Furthermore, pretreatment with the ERK/mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor 2'-amino-3'-methoxyflavone (PD98059) (5 μg i.c.) abrogated WIN55,212-2-evoked increases in blood pressure and neuronal ERK1/2 phosphorylation but not the reduction in Akt phosphorylation. On the other hand, prior PI3K inhibition with wortmannin (0.4 μg i.c.) exacerbated the WIN55,212-2 (7.5 and 15 μg i.c.) dose-related increases in blood pressure and ERK1/2 phosphorylation in the RVLM. The present neurochemical and integrative studies yield new insight into the critical role of two brainstem kinases, PI3K and ERK1/2, in the pressor response elicited by central CB?R activation in conscious rats.     

Protease-activated receptor-induced Akt activation – regulation and possible function

BACKGROUND: Thrombin induces the activation of the platelet serine/threonine kinase Akt. Akt activation is dependent on its phosphorylation at Thr308 and Ser473. The mechanism by which thrombin induces Akt phosphorylation is controversial, as is the role of Akt in platelet function. OBJECTIVES: To investigate how protease-activated receptors (PARs) stimulate Akt and the role that Akt plays in human platelet function. METHODS: Platelets were stimulated through PAR1 or PAR4. Specific inhibitors were used to evaluate, by Western blotting, signaling pathways regulating Akt phosphorylation, and the role of activated Akt was evaluated by aggregometry and flow cytometry. RESULTS: Phospholipase C (PLC) controls Akt phosphorylation elicited by PARs. Stimulation of PAR1 or PAR4 resulted in rapid Akt phosphorylation, independently of secreted ADP and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) activation. Akt phosphorylation approximately 60 s after PAR1 stimulation became entirely dependent on the purinergic receptor P2Y(12) and the activation of PI3K. In contrast, PAR4 partially sustained Akt phosphorylation independently of P2Y(12) and PI3K for up to 300 s. Pharmacologic inhibition of Akt reduced P-selectin expression and fibrinogen binding in platelets stimulated through PAR1, and delayed platelet aggregation in response to submaximal PAR1 or PAR4 stimulation, although aggregation at 300 s was unaffected. CONCLUSIONS: Platelet PAR stimulation causes rapid Akt phosphorylation downstream of PLC, whereas with continuous stimulation, ADP and PI3K are required for maintaining Akt phosphorylation. Activated Akt regulates platelet function by modulating secretion and alpha(IIb)beta(3) activation.     

Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl-2 family proteins

We tested whether isoflurane preconditioning inhibits cardiomyocyte apoptosis and evaluated the role of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt pathway in anesthetic preconditioning and determined whether PI3K/Akt signaling modulates the expression of pro- and antiapoptotic proteins in anesthetic preconditioning. Six-month-old New Zealand rabbits subjected to 40 min of myocardial ischemia followed by 180 min of reperfusion were assigned to the following groups: ischemia-reperfusion (I/R), isoflurane preconditioning and isoflurane plus PI3K inhibitors, wortmannin and 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-l-benzopyran-4-one (LY294002) (0.6 and 0.3 mg/kg i.v., respectively). Sham-operated, wortmannin+I/R, wortmannin+sham, LY294002+I/R, and LY294002+sham groups were also included. Infarct size was assessed by triphenyltetrazolium chloride staining. Apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling and activated caspase-3 assays. Akt phosphorylation, Bax, Bcl-2, Bad, and phosphorylated Bad (phospho-Bad) expression was assessed by immunoblotting. Isoflurane preconditioning reduced infarct size compared with the I/R group: 22+/-4 versus 41+/-5% (p<0.05). The percentage of apoptotic cells decreased in the isoflurane group (3.8+/-1.2%) compared with the I/R group (12.4+/-1.6%; p<0.05). These results were also confirmed by the activated caspase-3 assay. Wortmannin and LY294002 inhibited the effects of isoflurane. Myocardial infarction increased to 44+/-3 and 45+/-2% and the percentage of apoptotic cells was 11.9+/-2.1 and 11.7+/-3.3%, respectively. Akt phosphorylation and Bcl-2 and phospho-Bad expression increased after isoflurane preconditioning, whereas Bax expression decreased. These effects were inhibited by wortmannin and LY294002. The data indicate that isoflurane preconditioning reduces infarct size and myocardial apoptosis after I/R. Activation of PI3K and modulation of the expression of pro- and antiapoptotic proteins may play a role in isoflurane-induced myocardial protection.     

胰岛素对新生大鼠缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡的影响

目的探讨胰岛素对缺氧/复氧所诱导心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2h/复氧4h,建立缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation)心肌细胞损伤模型。于复氧期开始随机给予0.9%生理盐水(VC组)、胰岛素(INS组)、LY294002(LY组)、胰岛素 LY294002(INS LY组)干预。于复氧4h后,利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量,原位末端标记法(TUNEL)和DNA梯带法(DNALadder)标测细胞凋亡,免疫印迹法(Westernblotting)检测磷酸化Akt表达,并比较各组间差异。结果与VC组相比,INS组中LDH活性、MDA含量、凋亡指数(AI)显著降低(P<0.01),磷酸化Akt表达明显增加(P<0.01);但上述指标变化可被LY294002(PI3K抑制剂)所抑制。结论在复氧早期给予胰岛素干预可显著地减少缺氧/复氧所诱导的心肌细胞凋亡,其保护机制与PI3K/Akt所介导的抗细胞凋亡作用有关。     

BRL37344对大鼠心肌成纤维细胞磷脂酰肌醇(-3)激酶-蛋白激酶B信号通路的影响

目的 探讨β3-肾上腺素能受体(β3-adrenergic receptor,β3-AR)激动剂BRL37344是否通过细胞内磷脂酰肌醇(-3)激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)信号传导途径促进大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFbs)增殖及胶原纤维增生.方法 哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室无菌条件下剪取新生1～3 d的Wistar大鼠心脏,采用酶消化法、差速贴壁法获取CFbs.随机数字法分为5组:①空白组:不给予任何药物干预.②BRL组:给予BRL37344孵育.③LY组:给予LY294002(PI3K抑制剂)预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.④Akt-Ⅰ组:给予Akt-Ⅰ(Akt抑制剂)预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.⑤L-A组:LY294002和Akt-Ⅰ预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.通过MTT比色法观察细胞的增殖情况,RT-PCR法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况.组间进行单因素方差分析,组间比较采用Tukey检验.以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 ①CFbs中存在β3-AR.②与BRL组比较,LY组和Akt-Ⅰ组增殖减低(P＜0.01);L-A组较LY组和Akt-Ⅰ组增殖减低更明显(P＜0.01).③与空白组比较,BRL组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达均明显增加,给药48 h增加最显著.选取48 h点为作用时间点,与BRL组比较,LY组、Akt-Ⅰ组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达减低,L-A组较LY组和Akt-Ⅰ组表达减低更显著(P＜0.01).结论 BRL37344通过PI3K-Akt信号传导途径促进心肌成纤维细胞增殖和Ⅰ,Ⅲ型胶原表达增加.