人FcεRIα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制

应用两种不同的表达系统对FceR I α亚基的细胞外区进行克隆和表达,表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力,探索IgE与其高亲和力受体FceR I α亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FceRI α亚基的细胞外区,pBAD/gⅢA表达的FceR I α亚基的细胞外区能与IgE结合,而PQE30表达的FeaR I α亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FccR I α亚基的细胞外区已足够和IgE结合,无需β、γ亚基的存在,其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的,而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

CD23表达及其调控

IgEFc受体(FcεR)有FcεR Ⅰ和FcεR Ⅱ两种类型,后者即CD 23。它们的分子结构、抗原性、编码基因、表达调控、功能及与IgE的亲合力等特性均不相同。CD 23在细胞分化的特定时期和生长状态下呈现高表达。而对其精细调节机理了解甚少,因而对其表达及调控的研究有利于揭示它的功能,近年来这一领域的     

IgE高亲和力受体FcεRⅠ与过敏性疾病的治疗

IgE在一系列急慢性过敏反应如哮喘、变应性鼻炙、异位性皮炎、莩麻疹等疾病中发挥重要作用.IgE与靶细胞上高亲和力受体Fc epsilon RⅠ(FcεR Ⅰ)的结合被认为是Ⅰ型变态反应的关键步骤,FcεR Ⅰ功能主要是传递信号导致介质和细胞因子的产生及抗原呈递.通过抑制或者阻断IgE与FcεR Ⅰ的结合治疗过敏性疾病目前倍受国内外学者的关注.     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5．3细胞，获得大量的含抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱，分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果 分离纯化的单克隆抗体纯度高，活性强。结论 应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体。     

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE C...     

中国汉族人IgE重链恒定区CH2-CH4 cDNA的克隆

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤[1].     

IgE高亲和力受体蛋白的制备及其生物功能的鉴定

目的 通过基因工程技术制备人IgE抗体结合其高亲和力受体α段(FcεRIα)蛋白并对其生物学功能进行鉴定,为探讨FcεRIα在过敏性疾病中的作用奠定研究基础.方法 应用基于PCR的精确合成法(PAS)方法获得人FcεRIα基因,构建原核表达载体pET-FcεRIα,低温诱导表达FcεRIα并采用 His标签纯化重组蛋白;通过ELISA法鉴定重组人FcεRIα蛋白的生物功能.结果 扩增出大小约为560 bp的人FcεRIα基因;pET-FcεRIα质粒经双酶切及测序鉴定正确;诱导表达并纯化出相对分子质量大小约为22000的人FcεRIα;重组人FcεRIα能有效检测人血清中的抗FcεRIα自身抗体水平,并且能够与人血清中IgE抗体高效结合.结论 成功制备人FcεRIα蛋白,并初步具备检测人血清中抗FcεRIα自身抗体及IgE抗体的能力,为后续研究提供了有利的实践基础.     

中国汉族人IgE重链恒定区CH2、CH3及CH4亚基cDNA的克隆

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的相互作用则是这些Ⅰ型变态反应的重要调节步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点,所以了解这两个蛋白相互识别的方式以及结合的位点是极为重要的.     

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白真核表达质粒的构建

在人类哮喘及其他过敏反应性疾病中 ,肥大细胞始终处于重要地位。IgE的Fc段与肥大细胞上高亲和力受体FcεRⅠ相连接触发过敏反应。单独的Fc段能封闭其高亲和力受体 ,阻断过敏反应 ,且将关键结合位点定位于Fc段的CH3[1 3 ] 。国外研究发现 ,肥大细胞表面表达Fas,抗Fas抗体能够诱     

慢性自发性荨麻疹与外源性凝血系统启动因子TF的关系研究进展

<正>慢性自发性荨麻疹(CSU)的特征是在6周或更长的时间内,全身各部位自发地出现风团和瘙痒症状.荨麻疹的特征性症状是在皮肤肥大细胞和嗜碱性细胞被各种刺激激活后出现的,这些细胞释放几种生物活性物质,其中最重要的是组织胺.组织胺局部释放及组织胺H1受体拮抗剂(抗组织胺剂)可诱导血管舒张,增加血管通透性,刺激感觉神经末梢[1],从而导致出现红斑、丘疹和瘙痒等症状.研究结果显示,高亲和力IgE受体(FcεRⅠ)α亚基特异性IgG自身抗体是慢性荨麻疹     

肥大细胞FcεRⅠ受体介导的信号通路分子机制及影响因素的研究进展

Ⅰ型变态反应的发生与免疫球蛋白E(IgE)、肥大细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)以及变应原三者的交联有关.肥大细胞膜表面FcεRⅠ受体介导的信号传导通路具有复杂交错的分子机制,是过敏反应的关键效应步骤,该信号传导通路也成为药物治疗及免疫治疗的重要作用靶点.体液中的白细胞介素IL-4、IL-33,肥大细胞胞膜上的...     

IgE低亲和力受体基因mRNA表达水平与哮喘的关系

目的 探讨IgE低亲和力受c体(FcεRⅡ,CD23)基因表达水平在哮喘组与正常组间有无差异及基因表达与TlgE水平有无相关.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-Pc)检测FcεRⅡ基因表达水平,并用t检验作组间比较;直线相关分析基因表达与TlgE水平的相关性.结果 哮喘组TIgE水平与正常对照组之间差异有显著性(t=5.15,P＜0.01);FcεRⅡ基因表达水平在哮喘组与正常组之间差异有显著性(t=4.20,P＜0.01);在哮喘组与正常对照组中,FcεRⅡ基因表达水平均与TIgE水平间呈正的直线相关.结论 FcεRⅡ基因对血浆TIgE水平有调节作用,其功能变化在哮喘发病中可能有重要作用.     

CpG ODN对哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ、FcγRⅡb表达的影响

目的观察CpGODN对哮喘小鼠肺组织FcaRI、FcTRIIb表达的影响,探讨其诱导免疫耐受的相关机制。方法将48只清洁级雄性Balb／c小鼠随机分为正常对照组（A组）、哮喘组（B组）、地塞米松（DXM）治疗组（C组）、CpGODN治疗组（D组）,每组12只。以卵白蛋白（OVA）作用建立小鼠哮喘模型。收集支气管肺泡灌洗液（bronchialalveolarlavagefluid,BALF）计数细胞总数并分类,取肺组织作病理,反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）法测定肺组织中FcεRⅠ、FcγRⅡbmRNA的表达。结果（1）电镜观察肺组织超微结构：B组显示支气管及血管周围有较多炎性细胞浸润,肺泡隔内嗜酸粒细胞浸润,c组和D组与B组相比明显减轻。（2）BALF中炎症细胞表达变化：与B组相比,C组、D组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞（eosino—phil,EOS）绝对值以及EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均显著减少（P〈0．01）。（3）RT—PCR结果：C组、D组FcεRⅠ mR—NA表达均显著低于B组（P〈0．01）,C组、D组FcγRⅡb mRNA表达均显著高于B组（P〈0．01）。（4）相关分析：小鼠肺组织FcεRⅠ和FcγRⅡb表达呈显著负相关（P〈0．01,n=40）。结论CpGODN能降低哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ的表达,增加FcγRⅡb的表达,具有改善气道炎症和诱导免疫耐受的作用。     

扶正治标法对青少年花粉症患者相关基因表达的影响

目的:研究中药治疗花粉症的作用机理。方法:选择50例花粉症患者,口服敏康片,治疗6个月后观察疗效及FcεRIβ,IL-4Rα,IL-5Rα,HLA-A基因表达情况,并以20例变应性皮炎和19例正常人为对照,用Northern blot检测FcεRIβ,IL-4Rα,IL-5Rα的变化。用RT-PCR法检测HLA-A,计算相对光密度值。结果:花粉症组患者症状有明显改善(P<0.05),治疗前后血清总IgE比较差异有统计学意义(P<0.01),花粉症组4个基因的表达治疗前与正常人比较,差异均具有统计学意义(P<0.01),治疗后与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01)。变应性皮炎组治疗前FcεRIβ,IL-4Rα与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗前后FcεRIβ比较,差异有统计学意义(P<0.05)。鼻炎组、皮炎组HLA-A相对光密度值均较正常组高,两组治疗前后也有不同程度的改善(P<0.05)。结论:中药可以调整花粉症患者相关基因表达,改善患者过敏体质,缓解临床症状。     

扶正固本法对青少年哮喘患者基因表达的影响

目的 研究复方中药敏康片治疗青少年哮喘的疗效和作用机理。方法 选择20例青少年哮喘患者进行治疗，另设青少年特应性皮炎患者组（20例）和青少年正常组（19例）为对照。哮喘组和皮炎组口服敏康片，疗程为6个月，观察疗效、血清总IgE及FcεRIβ、IL-4Rα基因表达改变情况。结果 哮喘组显效6例，有效12例，无效2例，总有效率90％；皮炎组显效4例，有效13例，无效3例，总有效率85％；哮喘组IgE治疗前后有显著差异（P〈0．01）。皮炎组IgE治疗前后有差异（P〈0．05）；用Northern blot法检测FctRlt3、IL-4Rα基因，IL-4Rα吸光度值两组治疗前均较正常组高，哮喘组治疗后降低。FcεRIβ吸光度值两组治疗前均较正常组高，治疗后均降低。结论 复方中药可以调整青少年哮喘患者相关基因表达，改善患者过敏状态，缓解临床症状。     

人4—1BB—hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人4－1BB胞膜外区-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体。方法：PCR扩增人4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc基因片段，用HindⅢ、PstI酶切4－1BB胞膜外区，PstI、EcoR I酶切hIgG1Fc,HindⅢ、EcoRI酶切pCDNA3，纯化后的酶切产物经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，PCR及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对4－1BB胞膜外区和hIg1Fc的引物进行PCR扩增，电泳后观察到一558bp、708bp的特异性条带，与4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在pCDNA3质粒中的4－1BB和hIgG1Fc序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人4－1BB胞膜外区－hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体，为表达4－1BB融合蛋白奠定基础。     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRIα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5.3细胞,获得大量的含抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱,分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果分离纯化的单克隆抗体纯度高,活性强。结论应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体。     

FcεRⅠβ基因多态性与湖北地区儿童变应性哮喘的关系

目的　探讨IgE高亲和力受体 β链基因 (FcεRⅠβ)启动子 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly基因多态性与湖北儿童变应性哮喘及血浆总IgE的关系。方法　采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性技术检测 110例儿童变应性哮喘患者和 92例相匹配对照者FcεRⅠ β基因启动子区 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly两位点多态性。结果　①儿童变应性哮喘患者FcεRⅠ β基因启动子区 - 10 9位T/T、T/C和C/C基因型频率是 0 391、 0 4 91和 0 118;与对照相比差异无显著性意义 (χ2 =0 0 2 34,P >0 0 5 ) ,但儿童变应性哮喘组T/T基因型患者血浆总IgE对数值为 2 4 78± 0 94 4 ,与T/C基因型的 2 2 87± 1 114和C/C基因型的 2 315± 0 86 6相比差异具有显著性意义 (F =4 336 ,P <0 0 1)。②FcεRⅠ βGlu2 37Gly位点Glu/Glu、Glu/Gly和Gly/Gly型频率为 0 5 91、 0 36 4和 0 0 4 5 ,与正常对照相比差异具有显著性意义 (χ2=6 5 86 ,P <0 0 5 ) ,Gly/Gly型血浆总IgE对数值为 2 6 2 3± 0 96 2 ,与Glu/Glu的 2 30 6± 0 915和Glu/Gly的 2 4 18±0 894相比差异具有显著性意义 (F =6 6 5 4 ,P <0 0 1)。结论　IgE高亲和力受体 β链启动区 - 10 9位T/T型与血浆总IgE相关 ,编码区 2 37位Gly/Gly型与儿童变应性     

免疫复合物对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节

目的探讨免疫复合物(ICs)对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节.方法将U937细胞或中性粒细胞与各种免疫复合物共同孵育1 h后,用流式细胞仪分析细胞表面各种Fc受体的表达情况.结果 IgG1ICs和IgG3 ICs能上调U937细胞表面FcγRⅡ和FcγRⅢ以及中性粒细胞表面的FcγR I和FcαR I的表达.与各类免疫复合物孵育后中性粒细胞表面FcγRⅡ的表达呈降低趋势.结论免疫复合物能调节中性粒细胞和U937细胞Fc受体的表达,其中以IgG1 ICs和IgG3 ICs最为明显.