大鼠肝实质及非实质细胞分离和质量检测

目的　探索分离肝实质细胞及非实质细胞的合理条件。方法　应用胶原酶 /蛋白酶E消化分离和低速离心技术 ,以细胞活率、细胞产量和细胞纯度等指标检测细胞质量。结果　在 37℃ ,0 5g·L-1的胶原酶作用 30min ,80 0r·min-1离心条件下 ,肝实质细胞产量 (98× 10 9± 4× 10 9·L-1)、纯度 (97%± 2 % )和活率 (>90 % )最好。胶原酶和蛋白酶E合用 ,肝非实质细胞产量最高 (2 8 6× 10 9± 3 7× 10 9·L-1) ,Kupffer细胞纯度合理 (16 0 %± 3 5 % ) ,且Kupffer细胞含量符合体内正常分布。结论　本实验方法分离细胞对于进一步研究肝实质 ,尤其肝非实质细胞功能有实际意义。     

细胞治疗产品非临床活体示踪方法研究进展

细胞治疗作为肿瘤学研究和临床实践中的新型疗法,通过修复受损组织或替换身体缺陷细胞,在多种疾病治疗中发挥着越来越重要的作用.但对细胞治疗产品治疗疾病的机制和细胞移植后的宿主体内的分布和迁移情况并不非常清楚.细胞治疗产品的组织分布和存续时间是影响其有效性和安全性的重要因素,需进行动态观察.目前可选择的示踪技术包括影像学、聚...     

小鼠腹腔细胞作为人杂交瘤细胞饲养细胞的实验研究

在人杂变瘤细胞克隆化过程中，常规采用人外周血淋巴细胞(PBL)作为饲养细胞．但因PBL制备比较繁琐，来源有限，给实际工作带来不便。我们试用小鼠腹腔细胞作饲养细胞，并与PBL对比，证明两对人杂变瘤细胞的克隆化率及用性率没有显性差别。现将结果报告如下。     

上皮根鞘在无细胞牙骨质和细胞牙骨质形成中的作用研究

目的 观察无细胞牙骨质和细胞牙骨质发育时上皮根鞘细胞的增殖、凋亡的表达,探讨上皮根鞘在非细胞牙骨质和细胞牙骨质形成不同作用.方法 TUNEL法检测牙根发育中上皮根鞘细胞凋亡的情况.比较非细胞和细胞牙骨质形成时上皮根鞘细胞和牙周膜细胞的凋亡阳性表达指数,取α=0.05水准.SP免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA).结果 小鼠出生后第9天,无细胞牙骨质形成阶段,上皮根鞘细胞与牙周组织凋亡阳性表达指数未见显著性差异;出生后第19天,牙根根1/3为细胞牙骨质所覆盖,此时上皮根鞘细胞凋亡阳性表达指数高于牙周组织(P<0.05).结论 细胞凋亡调控上皮根鞘细胞的转归;上皮根鞘细胞在无细胞牙骨质和细胞牙骨质形成中的作用不尽相同.     

肿瘤多细胞起源研究进展

人类癌症研究的困惑之一是肿瘤的细胞起源问题.传统的细胞理论认为肿瘤起源于一个单细胞遗传和表观遗传变化的累积.一旦最初的变化发生,肿瘤启动并经过一系列累积变化最终发展为侵袭性表型.     

丙酮醛对体外施万细胞的损伤作用研究

目的 探讨不同浓度丙酮醛对体外施万细胞的损伤作用.方法 将RSC96施万细胞体外培养48 h后,改用不含血清的培养液培养12 h.实验分为空白对照组和1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L丙酮醛组.空白对照组不加任何药物处理,其余各组分别加入对应浓度丙酮醛,分别继续培养6 h和24 h后,显微镜下...     

牛磺酸与细胞凋亡

牛磺酸(Taurinet)是动物体内的一种含硫氨基酸,它广泛分布于生物体内各组织、器官,主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中,具有广泛的生物学作用。它主要存在于心肌细胞,对心肌细胞、神经细胞、肾脏细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等细胞的凋亡都有重要的影响,进而能对细胞有一定的保护作用。     

人肾透明细胞癌中ki-67 bcl-2 bax p53表达及癌细胞自发凋亡率的临床意义

目的　探讨人肾透明细胞癌中 ki- 6 7、bcl- 2、bax、p5 3表达及癌细胞自发凋亡率的临床意义。方法　选取 4 8例档存的肾透明细胞癌石蜡包埋标本 ,采用免疫组织化学方法检测癌细胞中 ki- 6 7、bcl- 2、bax、p5 3的表达 ,采用缺口末端标记法 ( TU NEL )检测癌细胞的自发凋亡率。结果　 ki- 6 7表达率 ( PI)为 0 .15 %～ 36 .4 % ,随TNM分期的增高而增高。癌细胞自发凋亡率 ( AI)为 0 .2 %～ 15 .4 % ,随 TNM分期的增高有上升趋势。各因子之间关系分析 :1高 bax表达组的癌细胞凋亡率高 ;2 p5 3阴性组的 AI高 ,bax高 ,PI低 ;3未发现 bcl- 2与其他因子间有相关关系。预后分析 :PI、AI、p5 3、bax、bcl- 2 / bax、TNM是预后因素 ,PI、p5 3是独立预后因素。结论　细胞增生状态、细胞凋亡状态以及凋亡调控因子的表达情况是影响肾透明细胞癌发生、发展的重要因素     

肝星状细胞凋亡机制研究进展

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝脏产生细胞外基质的主要来源，其大量增殖和凋亡相对不足在肝纤维化(hepatic fibrosis)的发生中起桉心作用，抑制其增殖和诱导其凋亡是逆转肝纤雏化的重要对策。肝星状细胞的凋亡受到凋亡和抗凋亡基因、细胞因子等的调控。现将Fas／Fasl系统、Bcl-2、Bax、p^53、Caspase家族及p^53与肝星状细胞凋亡研究概况综述如下。     

肿瘤干细胞来源的DC-CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤作用

【摘要】目的 观察干细胞负载树突细胞诱导的杀伤细胞（CSC-DC-CIK）作为效应细胞对同源肿瘤细胞的杀伤作用,探讨CSC 抗原参与肿瘤杀伤作用的可行性。方法 培养肾癌细胞株A498 和肺癌细胞株A549,用流式分选术分离纯化CD133+细胞,分别作为肾癌干细胞（KSC）和肺癌干细胞（LSC）,冻融法制备抗原。提取健康产妇脐带血的单个核细胞,体外扩增诱导生成DC 和CIK 细胞。分别用上述CSC 抗原负载DC,与CIK 共培养（CSC-DC-CIK）,流式细胞术分析DC 和CIK 细胞免疫表型,ELISA 法检测细胞因子分泌水平,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测CSCDC- CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤效率。结果CSC-DC 的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及HLA-DR+的表达均高于单纯DC 的相应免疫表型的表达（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+ 及HLA-DR+的表达均高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及 HLA-DR+的表达高于DC 与CIK 共培养后的相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+的表达高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+ 的表达高于DC 与CIK 共培养后的CIK 相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和 IL-2 分泌水平高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和IL-2 分泌水平高于DC 与CIK 共培养后的相应细胞因子表达（P < 0.01）;KSC-DC-CIK 组和LSC-DC-CIK 组对靶细胞的杀伤率为（50.21±4.24）% 和（49.32±3.89）%,明显高于DC-CIK 组的（30.25±3.11）%（F=89.157,P < 0.01）。结论 CSC 抗原负载DC 活化CIK （CSC-DC-CIK）对同源肿瘤细胞有更好的杀伤作用,对其作用机制和临床应用的可能性尚需深入研究。     

负载干细胞抗原的DC联合CIK细胞对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤杀伤研究

目的：研究不同乳腺癌细胞抗原负载的DC-CIK细胞对于乳腺癌荷瘤鼠体内肿瘤的杀伤效果及其与Wnt通路的关系。方法：分离乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的干细胞并制备冻融抗原,以此冲击由正常人外周血提取的单个核细胞诱导培养的DC-CIK细胞,注入已建立的MCF-7/ADR乳腺癌荷瘤鼠模型中,并且与普通抗原冲击的DC-CIK细胞,未经抗原冲击DC-CIK细胞,单纯CIK细胞,及生理盐水组建立实验组及对照组,观察此5组中小鼠肿瘤细胞生长情况,通过原位末端标记法（TUNEL）检测各组肿瘤组织凋亡情况,免疫组化法检测bcl-2,Bax及β-catenin表达情况。结果：实验组和对照组小鼠肿瘤体积在治疗后存在差异,同组小鼠肿瘤体积体积在治疗前后也存在差异,对照组小鼠肿瘤体积最大（3.6245±0.09264）cm3,经干细胞抗原冲击的DC-CIK治疗组肿瘤体积最小（1.2342±0.13116） cm3,其tunel染色阳性率最高,bax表达阳性最强,bcl-2,β-catenin表达较其他组最弱。结论：经乳腺癌干细胞抗原冲击的DC-CIK细胞对乳腺癌荷瘤鼠的肿瘤组织较强的杀伤效果,其机制可能是Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin表达降低,并引起bax表达增高,bcl-2表达降低,从而引起肿瘤细胞凋亡。     

耐药乳腺癌免疫治疗的实验研究

目的:探讨耐药乳腺癌抗原负载的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合培养后对同种乳腺癌荷瘤小鼠的可能治疗机制.方法:分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为DC和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC(AP-DC),分别将DC与CIK细胞共培养(AP-DC+CIK组、DC+CIK组),将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,观察不同组荷瘤标本中MDR1的表达、肿瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达.结果:AP-DC+CIK组、DC+CIK组、CIK组及生理盐水组MDR1/β-actin比值分别为0.14、0.57、0.81及0.98.生理盐水组、CIK组、DC+CIK组和AP-DC+CIK组平均凋亡指数差异有统计学意义(P＜0.001).各组Bcl-2及Bax蛋白表达的OD值差异有统计学意义(P＜0.01),Bcl-2/Bax值AP-DC+CIK组＜DC+CIK组＜CIK组＜生理盐水组.结论:经耐药乳腺癌抗原负载的DC与CIK共同作用后,诱导同种乳腺癌细胞凋亡强于单纯DC与CIK共同作用后及单独CIK的治疗效果.     

中晚期非小细胞肺癌化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗的临床效果评价

目的 观察中晚期非小细胞肺癌患者采用化疗联合树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞(DC-CIK)免疫治疗的临床效果.方法 选择2013年4月—2016年1月收治的中晚期非小细胞肺癌患者78例,按治疗方法分为观察组39例(紫杉醇+顺铂化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗)和对照组39例(单纯紫杉醇+顺铂化疗).采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤标志物细胞角蛋白19血清片段211(CYFRA211)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)的表达.采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群、CIK细胞及Treg细胞的数量和比例,采用实体瘤疗效评价标准评估临床疗效,采用卡氏功能状态评分评估生存质量改善情况.结果 治疗后两组血清CYFRA211、CEA和CA125水平明显低于治疗前(P<0.05),且观察组明显低于对照组(P<0.05).治疗后对照组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显低于治疗前(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显高于治疗前(P<0.05).治疗后观察组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显高于治疗前和对照组(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显低于治疗前和对照组(P<0.05).观察组生活质量提高率、有效率和疾病控制率明显高于对照组(P<0.05).结论 化疗联合DC-CIK细胞免疫能提高中晚期非小细胞肺癌患者的临床治疗效果,并且能显著改善患者的免疫功能和生活质量.     

来源于干细胞的树突细胞激活免疫细胞对同源白血病干细胞的杀伤作用

目的:探讨白血病干细胞(LSC)来源的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养对自身LSC的杀伤作用.方法:提取慢性粒细胞白血病加速期(CML-AP)患者的骨髓单个核细胞(BMMC),再应用CD34+CD38CD44+标记BMMC,流式分选仪分选出LSC并扩增、诱导出DC.取同源的单个核细胞诱导出CIK.用流式细胞技术检测DC和CIK细胞免疫表型、DC的p-糖蛋白(P-gp)耐药蛋白表达.荧光原位杂交(FISH)技术检测BCR/ABL融合基因在LSC及DC中的表达,乳酸脱氢酶释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效应.结果:CIK与DC共培养后,CD40、CD80、CD83及人类白细胞抗原(HLA-DR)的构成均高于共培养前;CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表达率高于共培养前,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01).干细胞来源DC的P-gp表达阳性率为(60.61±12.38)％.3种效靶比对应的杀伤率差异有统计学意义(P＜0.01),随着效靶比的增加,细胞杀伤作用增强.结论:白血病干细胞来源DC功能正常,与CIK共培养对自身LSC有杀伤作用.     

槐耳颗粒联合DC-CIK细胞对乳腺癌MDA-MB-231干细胞体内外杀伤作用研究

目的 探究白屈菜红碱（CHE）对腺样囊性癌细胞（ACC2）生长的抑制作用及机制。方法 利用CCK8法、EdU法、Hoechst33342/PI双染色法、试剂盒法检测CHE对ACC2细胞活力、细胞增殖、细胞凋亡和活性氧（ROS）水平的影响;通过Western blotting技术检测CHE对Cleaved-Caspase 3、PARP、NF-κB、p-JNK、p-p38蛋白表达的影响;利用斑马鱼移植瘤模型检测CHE对斑马鱼体内ACC2细胞生长的抑制作用。结果 CCK-8结果显示：与对照组比较,2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L的CHE显著降低ACC2细胞的存活率（P<0.05、0.01）,且呈浓度相关性; ROS检测结果显示：与对照组比较,5、8 μmol/L的CHE导致ACC2细胞内的ROS水平显著上升（P<0.05、0.01）; EdU增殖检测结果表明：与对照组比较,5、8 μmol/L的CHE致使ACC2细胞的增殖能力显著下降（P<0.01）;Hoechst/PI染色结果显示：与对照组比较,CHE 5、8 μmol/L组ACC2细胞凋亡率显著上升（P<0.01）。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）显著抑制CHE诱导的ROS水平升高、细胞凋亡增加（P<0.01）;Western blotting结果显示：2、5、8 μmol/L的CHE能够显著上调Cleaved-Caspase 3、PARP、NF-κB蛋白的表达（P<0.01）,且呈现浓度相关性,5、8 μmol/L的CHE能够显著上调p-JNK的蛋白表达（P<0.01）,8 μmol/L的CHE能够显著上调p-p38的蛋白表达（P<0.01）;NAC显著降低由CHE导致的Cleaved-Caspase 3、PARP、NF-κB、p-JNK、p-p38蛋白表达增加（P<0.01）,5、8 μmol/L CHE能够有效抑制斑马鱼体内肿瘤的生长（P<0.01）。结论 体外及斑马鱼移植瘤模型证明,CHE可以有效抑制ACC2细胞生长,其机制与提高细胞ROS水平,上调NF-κB、p-JNK、p-p38表达,从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡相关。     

恶性腹腔积液来源的树突状细胞与CIK共培养后对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的探讨恶性腹腔积液来源的树突状细胞（DC）与CIK细胞共培养后对SW620结肠腺癌细胞的体外杀伤作用。方法分离15例结肠癌患者的腹腔积液培养获得成熟DC,分离健康人外周血培养获得CIK细胞,DC细胞与CIK细胞共培养,流式细胞仪鉴定表型,MTT法检测各组对结肠癌细胞的体外杀伤作用。结果恶性腹腔积液中存在DC前体细胞,经体外细胞因子诱导培养后可获得成熟的DC细胞,高表达HLA—DR、CD80、CD83、CD86分子。DC与CIK共培养对SW620结肠腺癌细胞的杀伤作用较单独CIK组有明显差异（P〈0．05）。结论腹腔积液中存在DC前体细胞在体外诱导培养可获得功能正常的成熟DC细胞,与CIK共培养后可增强其体外杀伤毒性。     

耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探

目的 耐药乳腺癌表现为治疗效果差,转移率高,死亡率高的一种恶性程度极高的肿瘤性疾病。有研究表明,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在树突细胞（DC）辅助下,对耐药肿瘤细胞的杀伤能力可能超过T细胞。本实验利用DC与CIK联合培养,比较在不同条件下对乳腺癌多药耐药细胞株的杀伤效应。 方法 分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为树突细胞（DC）和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC（AP-DC）,分别将DC与CIK细胞共培养（AP-DC+CIK 、DC+CIK）,CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,酶联免疫吸附法（ELISA）测定分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,MTT法测定细胞毒效应。结果 DC和CIK细胞共孵育,使CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例及分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平增高,DC的成熟表型和分泌IL-12的水平增加,其中均以AP-DC+CIK组增高最为明显,和其他组间比较差异有统计学意义。对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒效应,AP-DC+CIK组杀伤效应最强, 与DC+CIK组和CIK组比较差异均有统计学意义;结论 经耐药肿瘤抗原负载的DC与CIK共同作用后,其对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抗瘤免疫能力最强,为临床治疗耐药肿瘤带来希望。     

DC-GPC3联合CIK 细胞的体外抗肝癌作用

摘要： 目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 （GPC3） 基因转染的树突状细胞 （DC-GPC3） 与细胞因子诱导杀伤细胞（CIK） 共培养 （DCIK-GPC3） 后, 对 CIK 的生物活性及体外抗肝癌细胞作用。方法 流式细胞术检测 DCIK-GPC3、 DC-CIK 及 CIK 各组效应细胞免疫表型, MTT 法检测各组效应细胞培养上清液中白细胞介素 （IL） -2 生物活性, 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测细胞培养上清液中 IL-2、 干扰素 γ （IFN-γ） 浓度。乳酸脱氢酶释放实验分别检测各组效应细胞对肝癌 HepG2 细胞的细胞毒活性。结果 DCIK-GPC3 表面高表达 CD3+ CD8+ 和 CD3+ CD56+ 双阳性细胞, 与 DCIK 及 CIK 比较差异有统计学意义 （P＜0.05）; CIK、 DCIK、 DCIK-GPC3 培养上清液中 IL-2 生物活性、 浓度以及 IFN-γ 浓度均依次升高, 组间多重比较差异有统计学意义 （P＜0.05）; 在 20∶1 及 50 ∶1 效靶比, CIK、 DCIK、 DCIK- GPC3 对 HepG2 细胞的细胞毒活性依次升高, 组间多重比较差异均有统计学意义 （P＜0.05）。结论 CIK 与 DC- GPC3共培养可获得更强的体外杀伤肝癌细胞活性, 为DCIK-GPC3用于临床免疫治疗提供了理论和实验依据。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肺癌的实验研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外能否有效的抗肺癌。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM—CSF,IL-4及TNF—a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN—g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物．作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。CytotoxicityTOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性。结果在培养的第15d．与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23．4±2．3）倍vs（16．7±2．7）倍,P〈0．05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64．3±3．6）％vs（43．9±2．1）％,P〈0．05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强。结论DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK抗肺癌的活性．将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。