菝葜RAPD扩增条件优化

目的研究菝葜的RAPD-PCR扩增体系最适宜的条件。方法采用CTAB提取方法,从菝葜的嫩叶中提取总基因组DNA,以此为模板,优化菝葜RAPD-PCR的反应条件。结果 最适宜的PCR扩增体系为:反应体积30μL,内含0.20μmol/L引物、200μmol/L dNTP4、0 ng模板DNA、2 UTaqDNA聚合酶、2μmol/L Mg2+。结论通过扩增条件优化实验,建立了重复性好、稳定性高的药用植物菝葜RAPD-PCR扩增体系最适宜的条件,筛选出条带清晰多态性好的14条随机引物,共扩增得到144条电泳带,其中有多态性带62条,检测到了62个多态性位点,多态率为43%。     

拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

对叶百部基因组DNA提取及ISSR-PCR体系优化

目的建立适合对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR最佳反应体系。方法通过改良的CTAB法提取对叶百部基因组DNA,并采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的5种因素(d NTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq聚合酶)4个水平进行正交试验,优化ISSR-PCR反应体系。结果确立了对叶百部最佳反应体系,即在20μl的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μl,d NTP 175μmol/L,Mg2+1.7mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 15ng。结论建立并优化了对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

驴皮药材RAPD分析方法建立及其与伪品马皮的鉴别

目的 建立驴皮药材RAPD分析方法并用于伪品马皮的鉴别.方法 采用化学试剂盒法确定了驴皮药材中DNA提取的最佳条件,采用L16(45)正交设计方法,针对Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物设计了5因素4水平的正交试验,优化了RAPD-PCR反应条件.结果 驴皮药材RAPD-PCR反应体系的最佳条件为25 μL反应体系中含有Taq酶1.5U、Mg2+0.15 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、模板DNA 1.5 μL、引物0.5 μmol/L;PCR反应条件为95℃预变性5 min,94℃变性30 s,37℃退火30s,72℃延伸1 min,共30个循环,最后72℃延伸7 min.RAPD反应结果中300～400 bp处的条带可作为鉴别驴皮及其伪品的特异性条带.结论 所建立的RAPD分析方法具有简便快捷、稳定性好、重现性高的特点,可用于驴皮药材及其伪品马皮的鉴别.     

综合评分法优化柴胡RAPD-PCR反应体系

目的采用综合评分法优化柴胡RAPD-PCR的反应体系.方法以柴胡基因组DNA为模板,应用L16(4 5)正交表.研究了Taq酶、Mg2 、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果优化反应体系为25 μL反应体系中含有1 × buffer、Taq 酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、模板DNA50ng.结论综合评分法能客观高效的优化柴胡RAPD反应体系.     

蒲公英总DNA的提取及其RAPD-PCR反应条件的优化

目的 建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系.方法 采用改良的CTAB法提取基因组DNA,对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系.25 μl反应体系中含有:1×Taq Mix buffer,50 ng DNA模板,0.4 μmol/L 引物,1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs,1.25U Taq酶.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,38℃复性1 min,72℃延伸2 min,共40个循环;72℃延伸10 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

正交设计优选昧连简单序列重复间扩增多太性反应体系的研究

目的 优化味连简单序列重复间扩增多太性(Coptis chinensis Franch.ISSR)反应体系.方法 利用正交实验设计,从Mg2 ,dNTP.引物,BSA这4种因素3个水平进行优化.结果 确立了适合黄连ISSR分析的反应体系,即在25 μl反应体系中,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L Mg2 ,200 μmol/L dNTP,0.4 μmol/L引物,40 ng模板,1U Taq DNA聚合酶,BSA 1 μg/μl.结论 利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱.     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

三叶青基因组DNA提取与ISSR体系构建

目的构建三叶青ISSR反应体系,为三叶青种质资源遗传多样性分析、品种选育与分子鉴定奠定基础。方法用常规CTAB法、SDS法、改良CTAB法、试剂盒法提取三叶青叶片基因组DNA,采用正交设计试验L12(34),在4个主要因素的3个水平上进行ISSR体系构建,用12个不同种源三叶青样品验证体系稳定性。结果改良CTAB法提取的三叶青叶片基因组DNA质量最好,纯度高,试剂盒法次之,常规CTAB法与SDS法所提DNA质量较差。构建的ISSR最佳反应体系为:20μl反应体系中,Taq酶用量0.5U,模版DNA20ng,d NTPs0.20mmol/L,引物0.4μmol/L,2μl 10×Buffer缓冲液(Mg2+浓度1.5mmol/L)。结论采用正交设计方法构建的三叶青ISSR体系经检验,稳定可靠,可用于三叶青种质资源遗传分析。     

正交设计法优化川木通RAPD-PCR体系研究

目的 确定川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平,最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件.方法 采用正交设计L_(16)(4~5)在4个水平上对川木通类植物进行RAPD-PCR进行试验.两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析.结果 最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件为:20 μl体系,其中含1×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl_2,0.15 mmol/L dNTPs,1.0 U Taq酶,0.5 μmol/L 10-mer引物,50 ng模板DNA,最终确定退火温度36℃.同时发现Taq酶对反应体系影响最大.结论 建立了可靠的反应体系,为该类药材的分子鉴定奠定了基础.     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化

目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。     

黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化

目的探索黄连药材DNA的提取并对其RAPD反应体系进行优化。方法采用目前较为流行的苯酚法、CTAB法、高盐低pH值法,通过电泳、紫外分光光度仪检测及RAPD扩增效果确定黄连药材基因组DNA提取的最佳方法。结果CTAB法为黄连药材基因组DNA提取的最佳方法,建立了适合黄连药材的RAPD反应体系:25μL体系中内含1×PCRbuffer、2mmol/LMg2 、100~150μmol/LdNTP、20ng引物、40ng模板、1UTaq酶。结论CTAB法及黄连药材的RAPD反应体系可以用于黄连药材的RAPD分析。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

华中五味子性别相关的分子标记建立

目的:建立华中五味子性别相关的RAPD标记。方法:以华中五味子雌雄株嫩叶为材料,用改良CTAB法分别提取基因组DNA,通过单因子与正交实验优化RAPD反应体系,对其性别的基因组差异进行研究。结果:25μL总体积:Mg2+浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度0.08 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,Taq酶1.5 U,DNA模板60 ng,退火温度41.3℃,循环次数35个。在400条随机引物中,只有S353筛选得到一条541 bp的雄性特异条带。结论:该标记可作为其性别鉴定依据。     

金樱子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的为获得稳定的金樱子ISSR反应体系。方法采用L16(45)正交试验设计,以金樱子DNA为模板,研究PCR反应体系中5种主要成分,即Mg2+、d NTPs、Tag酶、引物及模板对金樱子ISSR-PCR扩增结果的影响。结果金樱子ISSR在20μl的最佳反应体系中,Mg2+浓度为0.5mmol/L,Tag酶为0.9 U/μl,d NTPs为0.3 mmol/L,引物为0.2(100μmol/L),模板DNA用量为2ng/μl。结论实验结果可用于金樱子ISSR的构建。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

正交试验优化黄连ISSR反应体系的研究

目的:优化黄连(味连,Coptis chinensis Franch.)ISSR反应体系。方法:利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物、BSA4种因素3个水平进行优化。结果:确立了适合黄连ISSR分析的反应体系,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol/L Mg2 、200μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、40ng模板、1U TaqDNA聚合酶。结论:利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱。