结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的 对分支杆菌的一种分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ的基因进行克隆、表达,为结核病进行诊断打下基础。方法 以结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ株基因组ＤＮＡ为模板,以ＰＣＲ法对基因ａｇ８５ｂ进行扩增,产物与载体质粒ｐＥＴ２４ｂ构建表达Ａｇ８５Ｂ的重组质粒,将此重组质粒先转化入大肠杆菌ＤＨ５ａ内,抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）菌株内,对转化菌株以ＩＰＴＧ进行诱导后,破菌,离心,上清进行ＳＤＳ－     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

一种单纯疱疹病毒共有型单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的：建立能稳定分泌单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）共有型单克隆抗体（Ｍａｂ）的细胞株并进行初步鉴定。方法：本研究利用杂交瘤技术建立了 １３株能稳定分泌抗 ＨＳＶ 特异性 Ｍａｂ的杂交瘤细胞株,其中 ５株能稳定分泌抗 ＨＳＶ型共有单克隆抗体（５Ｂ４－２、５Ｂ４－６、６Ｂ３－２－３、Ｄｂ４、Ｅｂ４）,并对５Ｂ４－６株进行了初步鉴定。结果：免疫双扩散法确定Ｍａｂ５Ｂ４－６的 Ｉｇ类型为 ＩｇＧ２ｂ。经微量免疫荧光法（Ｍｉｃｒｏ－ＩＦＡ）法测定杂交瘤培养上清及腹水中单抗效价,分别为 １∶１６及１∶２０４８０。杂交瘤细胞核型分析显示其染色体数目为９１．８±６．２。杂交瘤细胞经４次克隆,传代６个月仍能稳定地分泌抗体。用免疫印渍法进一步鉴定Ｍａｂ５Ｂ４－６所结合抗原的分子量约为７７ＫＤ。结论：细胞株５Ｂ４－６能稳定分泌一种新奇的针对具有ＨＳＶ型共有抗原表位的７７ＫＤ 蛋白的特异性单抗。     

乙肝病毒在转染细胞（z7－4）中复制的探讨

用ＨＢＶ　ＤＮＡ二聚体转染高度分化的人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ２），筛选出具有分泌病毒抗原、核酸以及释放４２ｎｍ　Ｄａｎｅ颗粒能力的ｚ７－４细胞株。本实验结果支持３．５ＫｂｍＲＮＡ是前病毒基因，以它作模板可逆转录成１．６Ｋｂ（－）ｓｓＤＮＡ，再合成（＋）ｓｓＤＮＡ，最后装配成４．０Ｋｂ和３．２ＫｂｄｓＤＮＡ。在ＤＮＡ印迹法中位于４．０Ｋｂ（Ｄ１）和３．２Ｋｂ（Ｄ２）处是病毒的松驰环状双股ＤＮＡ（ＲＣＤＮＡ），而１．６Ｋｂ和１．２Ｋｂ处的２条ＤＮＡ带（Ｓ１和Ｓ２）均为单股ＤＮＡ，这些不同位置的ＤＮＡ带与病毒复制过程中ＤＮＡ的构型和片断大小不同有关。本实验未能发现２．０ＫｂｃｃｃＤＮＡ，但提示了负股ＤＮＡ５’端连接有蛋白质引物。     

抗结核杆菌单克隆抗体的研制及初步鉴定

运用单克隆抗体技术,以结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ的培养滤液免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以Ｈ３７Ｒｖ及ＢＣＧ抗原同时筛选杂交瘤细胞,得到了７析稳定分泌的抗结核杆菌的杂交瘤细胞株,并对它们的特性作了初步鉴定。在７株单克隆抗体杂交瘤中,５株（２Ｃ５、２Ｃ１１、２Ｄ１、２Ｅ１１及３Ｄ３）为ＩｇＧ１亚类,另两株（３Ｃ３及５Ｄ８）为ＩｇＭ。腹水经ＥＬＩＳＡ检测,效价可达１０＾－３～１０＾－４,同时应用ＥＬＩＳＡ及免疫印迹试     

卵巢癌组织表达人源性单克隆抗体识别的肿瘤相关抗原

应用抗卵巢癌人源性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）ＡＴ４对人卵巢肿瘤进行免疫组织化学分析，以观察ＡＴ４识别的肿瘤相关抗原在人卵巢癌组织中表达的发生率和意义。所用材料为福尔马林固定和石蜡包埋的活检标本。切片经过氧化物酶抗过氧化物酶（ＰＡＰ）染色。结果发现：原发性卵巢癌的ＭｃＡｂＡＴ４免疫组织化学染色的阳性率为５／６，转移性卵巢癌为３／６，良性卵巢肿瘤为３／２１。本研究结果表明，人源性ＭｃＡｂＡＴ４识别的肿瘤相关抗原ＣＡＴ４是卵巢癌的免疫组化标记     

抗人IgG单克隆抗体制备和鉴定

以人ＩｇＧ为抗原，采用杂交瘤技术获得６株不同性质的抗人ＩｇＧ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）（ＡＩ２，ＡＩ３，ＡＩ４，ＡＩ５，ＡＩ６和ＡＩ７）。ＡＩ２ＭｃＡｂ具有抗ＩｇＧ１亚类的特异性，可识别ＩｇＧγ链和Ｆ（ａｂ）２片段，作用位点可能在人ＩｇＧ１铰链区。ＡＩ３，ＡＴ７，ＭｃＡｂ分别为ＩｇＧ３，ＩｇＧ４亚类限制性ＭｃＡｂ，可能作用于ＩｇＧＣＨ１区。ＡＩ４ＭｃＡｂ铰链区。ＡＩ３，ＡＩ７，ＭｃＡｂ可识别ｘ和λ链。     

卡托普利治疗高血压病伴糖尿病及糖尿病肾病的临床观察

选择２６例原发性高血压（ＥＨ）伴Ⅱ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ），其中糖尿病肾病（ＤＮ）１２例，加用卡托普利３７．５～１１２．５ｍｇ／日口服治疗，共４周．结果：收缩压（ＳＢＰ）／舒张庄（ＤＢＰ）由２１．９±２．３／１３．５±０．５ｋｐ＿ａ降为１９．３±１．５／１２．２±０．８Ｋｐ＿ａ（Ｐ＜０．０１），空腹血糖／餐后２小时血糖由１０．７±４．５／１３．７±３．９ｍｍｏｌ／Ｌ减为６．５±１．６／１０．２±２．７ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）；２４小时尿蛋白由１．９±０．３ｇ减为０．６±０．３ｇ（Ｐ＜０．０１）．表明该药在降压的同时确有改善糖代谢、降低尿蛋白排泄的作用。     

人胃癌细胞株Rb抗癌基因缺失的研究

以Ｒｂ基因ｃＤＮＡ３．８Ｋｂ片段做探针，经非放射性地高辛－ｄＵＴＰ及放射性同位素α－＾３２Ｐ－ｄＣＴＰ两种标记方法标记，对６株人胃癌细胞株的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，显示５株细胞Ｒｂ基因完全缺失，１株不全缺失伴突变。     

人胃癌细胞株Rb抗癌基因缺失的研究

以Ｒｂ基因ｃＤＮＡ３．８Ｋｂ片段做探针，经非放射性地高辛—ｄＵＴＰ及放射性同位素α－３２Ｐ－ｄｃＴＰ两种标记方法标记，对６株人胃癌细胞株的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，显示５株细胞Ｒｂ基因完全缺失，１株不全缺失伴突变。     

PCR方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株

目的:用3对引物PCR扩增的方法对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.方法:将3对特征性的结核分枝杆菌标记基因:MPT40基因、α抗原基因和IS6100插入序列,分别放入PCR体系中,在各自的退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.结果:用3对引物PCR扩增的方法可将各种类型的结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开.结论:3对引物PCR扩增的方法是一种有效的结核分枝杆菌菌种鉴定的方法,可用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及各种类型的结核分枝杆菌的区分.     

PCR-SSCP分支杆菌菌种初步鉴定方法的建立及其应用

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法：通过聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｕｉｎｇｌｅ－ｓｔｒｎｄｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｌｏｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）方法分析分枝杆菌１６ＳｒＲＮＡ,根据其电泳图谱与标准株的相似性进行菌种初步鉴定。结果：２９种分支杆菌标准株中,除结接分支杆菌、牛结核分支杆菌和卡     

Tuberculosis in the west of Ireland 1986–1990

A review of mycobacteria isolated from clinical samples from the Western Health Board Area (WHBA) for the years 1986 to 1990 was performed to establish the pattern of mycobacterial infection. The incidence of microbiologically proven cases of tuberculosis (13.3/100,000) and of sputum smear positive cases (6.2/100,000) was determined and correlated with notification data. M. bovis accounts for 6.3% of cases of microbiologically confirmed tuberculosis in this area. Resistance to one or more of the first line anti-tuberculous drugs was noted in 5.3 % of isolates (excluding pyrazinamide resistance in M. bovis). Clinically significant isolates of mycobacteria other than tuberculosis (MOTT) were rare throughout the five year period. The overall incidence of microbiologically proven cases of tuberculosis is relatively high and M. bovis and drug resistant isolates of M. tuberculosis are relatively common.     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

结核杆菌体内诱导基因的筛选及初步分析

目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因,进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库,应用体内诱导的抗原技术,用吸收过的结核患者血清筛选文库,对阳性克隆测序得到开放阅读框（ORF）。结果实验共确定了51个ORF。按照功能分为8类：毒力、解毒及调节相关基因1个,细胞壁与细胞处理相关基因13个,中间代谢和呼吸相关基因11个,脂类代谢基因7个,信号通路基因2个,PE／PPE蛋白家族基因3个,保守假设蛋白基因12个,与牛型分支杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因,其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。     

北京基因型结核分枝杆菌感染THP-1细胞系表达谱的研究

目的通过分析不同结核分枝杆菌感染巨噬细胞后表达谱的改变,探讨结核病(tuberculosis,TB),尤其是北京基因型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis M.tb)感染的结核病免疫发病机制。方法具有IS6110 DNARFLP和Spoligotyping基因分型结果的265株北京基因型结核分枝杆菌(简称M.tb Beijing genotype)鉴定自2000年中国结核病流行病学抽样调查(简称2000年流调),采用平均连锁方法计算北京基因型结核分枝杆菌中心菌。结核分枝杆菌(M.tb H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)标准菌株和M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞,采用基因芯片分析其表达谱的改变。结果输入MAS系统,行进一步的分析。结果依据计算原则,相似系数最大为0.514,其对应菌株为结核分枝杆菌北京基因型中心菌株。分枝杆菌感染THP-1细胞后相应的芯片结果具有可靠性和可分析性。M.tb H37Rv、M.bovis、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞的共同表达293个基因。共同表达基因的GO和pathway分析,发现一些不为人特别关注,但对结核免疫有一定作用的信号通路,例如B细胞受体信号通路。M.tb H37Rv、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞差异表达基因包括:tnf,tnfrsf9,pim-1,icam-1和cd48。结论 2000年结核病流调以中国人口为整体,采用分层整群随机抽样。因此获得的M.tb Beijing genotype中心菌株具有中国代表性。293个基因可作为筛选用于菌阴结核病诊断的候选靶标。对这些差异表达基因涉及的信号通路,例如:JAK-STAT信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性以及TNF的深入分析,将对理解M.tb Beijing genotype免疫毒性特征有益。     

Efficacy of a new quarternary ammonium compound against TB

Ten of 12 strains of Mycobacteria (11 M. tuberculosis, 1 M. bovis) including 7 resistant strains were found to be sensitive to tetradecyl-dimethyl-benzyl-ammonium fluoride (TDBAF) at a concentration of 15–7.75 μg/ml (end point 10 μg/ml). A single multi-resistant strain of M. tuberculosis and a culture of M. bovis were also sensitive but at a slightly higher level.     

Mycobacterial species causing pulmonary tuberculosis at the korle bu teaching hospital, accra, ghana

Summary OBJECTIVE: Characterize mycobacterial species causing pulmonary tuberculosis (PTB) at the Korle-Bu Teaching Hospital in Ghana. DESIGN: Sputum smear positive samples, two (2) from 70 patients diagnosed as having tuberculosis, after they had consented, were collected from the Korle-Bu Teaching Hospital Chest Clinic between January and July 2003. SETTING: Korle-Bu Teaching Hospital Chest Clinic, Accra. RESULTS: Sixty-four mycobacterial isolates were obtained and confirmed as members of Mycobacterium tuberculosis complex by colonial morphology and conventional biochemical assays. Forty-seven (73%) were M. tuberculosis, the human strain, 2 (3%) M. bovis, the bovine strain, 13 (20%) M. africanum I (West Africa type), and 2 (3%) M. africanum II (East Africa type). CONCLUSION: The results indicate that, there are various strains causing PTB at the Korle-Bu Teaching Hospital and of great concern is M. bovis, which mostly causes extra-PTB in humans but found to cause PTB in this study. This calls for the need to conduct a nationwide survey using both conventional and molecular techniques to characterize various mycobacterial species causing TB in Ghana. This will result in better understanding of the various strains circulating in the country and inform individual TB treatment regimen especially the inclusion or exclusion of pyrazinamide.     

结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分支杆菌菌种

目的建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法通过 1 6SrDNA聚合酶链反应 单链构象多态性 (polymerasechainreaction singlestrandedconformationpolymorphism ,PCR SSCP)分析鉴定 1 4 0株分支杆菌临床分离株 ;设计与合成用于鉴定分支杆菌菌种的 1 6SrDNA寡核苷酸探针 ,制作膜芯片 ,与待测菌株生物素标记的 1 6SrDNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果 1 4 0株分支杆菌临床分离株中 ,经 1 6SrDNAPCR SSCP初步鉴定 ,1 33株为结核分支杆菌复合群 ,7株为非结核分支杆菌。经膜芯片杂交分析 ,1 33株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群 ;7株非结核分支杆菌中 ,1株鉴定为戈登分支杆菌 ,1株为土分支杆菌 ,1株为偶发分支杆菌 ,1株为胞内分支杆菌 ,另 3株与分析探针杂交阴性。分析 2 8种分支杆菌标准菌株和 9种非分支杆菌菌株 ,结果显示寡核苷酸探针是特异的。结论 1 6SrDNAPCR 膜芯片技术灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于鉴定分支杆菌菌种