实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

沙门菌invA基因荧光定量PCR检测

沙门菌是引起食源性感染的常见致病菌^[1],常规检测方法有分离培养、生化鉴定、血清学试验等.由于沙门菌有2 000多种血清型,因而监测工作多繁琐、费时、费力.实时荧光定量PCR检测技术是近年来的新方法,已经愈来愈多地用于病原体诊断^[2].研究表明,沙门菌侵袭基因invA高度保守,几乎存在于沙门菌所有血清型中,其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白,决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力,与其致病性显著相关^[3].根据这一特点,为探讨快速、敏感、稳定的沙门菌检测方法,本研究应用沙门菌侵袭基因invA设计引物和探针序列,建立沙门菌荧光定量检测方法并研制沙门菌检测试剂盒.     

实时荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定及筛选中的应用

目的在沙门菌鉴定中运用taqman技术建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法,并考评该方法的特异性、灵敏度、抗干扰性及重复性。方法根据沙门菌GenBank Accession NO DQ644631基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。建立实时荧光定量PCR反应体系,用沙门菌各种型别对该方法进行考评。结果实时荧光定量PCR技术在沙门菌鉴定中有良好的特异性、极高的灵敏度、较强的抗干扰性及重复性。结论在沙门菌的鉴定和筛选中实时荧光定量PCR方法准确、快速、简便,有很好的应用前景和研究价值。     

荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用

[目的 ]　用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测方法 ,尝试快速、准确地鉴定沙门菌。　 [方法 ]　根据沙门菌GenBankAccessionNOU2 5 3 5 2基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体 ,构建的重组质粒经筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的制定。利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定。　 [结果 ]　应用重组质粒制作的定量曲线 ,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 .999。检测各类菌株 ,其中沙门菌 41株、H抗原丢失的沙门菌 16株均阳性 ;非沙门菌 10 9株均阴性。　 [结论 ]　建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法 ,该方法简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立一种快速、灵敏、准确的检测方法,预防沙门菌食物中毒。[方法]根据沙门菌保守基因序列fimY基因设计合成了引物和TaqMan探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。[结果]其检测灵敏度达到4．5efu,比常规PER高100倍,而且稳定性良好,冷冻至少可以保存9个月。[结论]通过临床样品的检测,该试剂盒具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性强等优点,很适合大量样品的检测。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较

沙门菌是一种常见的重要人兽共患病原菌，在自然界中分布广泛，它极易污染水源、食品及畜产品，引起人食物中毒、急性胃肠炎和动物腹泻等疾病。目前国内外对该菌的快速检测主要集中在免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）技术等方法上。而实时荧光PCR（Real-timePCR）是近几年兴起的分子生物学检测技术，其检测灵敏性高，特异性好且操作简便，耗时少。     

沙门菌和志贺菌二联实时荧光定量PCR的临床检测应用研究

目的:进行沙门菌和志贺菌二联实时荧光PCR检测的研究,并探讨在CDC体检中临床检测的应用.方法:在沙门菌、志贺菌的fimY基因和缸ipaH基因保守区设计特异性引物和探针,对引物、探针、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,并与传统检测方法进行对比.结果:该方法从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,对两种菌的检测灵敏度均达到100 cfu/ml,检测自2007年11月以来CDC临床肛拭子样本5896份,实验结果与权威检验机构的结果符合率达100%.结论:二联实时荧光定量PCR可同时定量的检测出沙门菌和志贺菌,灵敏度高,特异性强,检测周期短.适用于CDC体检等同时对沙门菌和志贺菌的快速临床检测.     

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

实时荧光PCR方法检测水产品中沙门菌

[目的]探索沙门菌快速检验法，加快水产品检验检疫通关速度，促进外经贸经济的发展。[方法]用深圳太太基因工程有限公司提供的沙门菌实时荧光PCR试剂盒对水产品样本进行检验。[结果]用实时荧光PCR从多个水产品样品的增菌液中检出9份样品沙门菌阳性，用传统的微生物生理生化培养法从该9份样品中分离出9株沙门菌。根据血清分型、API鉴定和荧光PCR结果，确认所分离的菌株中有沙门菌B群3株、C1群4株、D群1株、其他群1株。[结论]实时荧光PCR方法在沙门菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势，有利于提高沙门菌的检出率，具有广阔的运用前景。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

应用PCR法检测沙门菌

目的 研究沙门菌的PCR检测方法.方法 引物选择沙门菌的hilA基因,应用PCR法检测沙门菌.结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的沙门菌,扩增片段在497 bp.结论 应用PCR检测沙门菌,具有快速、特异、灵敏和简便的特点.     

基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中的沙门菌

目的:建立基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中沙门菌的检测体系。方法:根据沙门菌外膜蛋白Ompc基因的保守序列,设计1对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应体系和反应条件进行优化。利用建立的检测方法对舟山水产品加工厂和舟山菜市场采集的120份样本进行检测。结果:该检测方法可以达到1μl 1.0×101拷贝数量级的灵敏度。样品检出率为10.0%,与国标法检测结果一致。结论:本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简便快速的实现对水产品中沙门菌的检测。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

荧光定量PCR监测单核细胞增多性李斯特菌研究

目的 探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法 以单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因作为靶序列设计一对引物，并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板，用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果 含有一段特征基因的600bp片段，具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论 荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

沙门菌和志贺菌双重实时荧光定量PCR的应用效果评价

目的研究沙门菌和志贺菌双色实时荧光PCR法的应用价值。方法收集2017年8月到2018年4月深圳市西丽人民医院临床肛拭子样本2700份,运用双色实时荧光PCR法检测沙门菌与志贺菌,统计阳性检出率,并与培养法的检测结果进行对比。结果 2700份样本中,培养法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为2株、0株,检出率分别为0.07%、0.00%,双色实时荧光PCR法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为6株、3株,检出率分别为0.22%、0.11%,双色实时荧光PCR法检出率高于培养法,对比差异有统计学意义(P0.05)。结论双色实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌的临床效果显著,具有较高的特异性、敏感度及准确率,值得临床推广与应用。     

改良分子信标-实时荧光PCR同时检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌

目的 建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断.方法 根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立...     

脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR法检测

目的 评价新型水解探针(TaqMan-MGB探针)荧光定量PCR法在检测脑膜炎奈瑟菌中的应用价值.方法 分别采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法、常规PCR法和传统分离培养法检测230例无症状者咽拭子标本,比较3种方法的检出率.结果 3种方法的阳性检出率分别为10.43%,6.52%和3.48%;TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法的检出率高于常规PCR法和传统分离培养法(P<0.001).结论 TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法检测脑膜炎奈瑟菌具有灵敏、特异、快速方便的特点,可为流脑流行病学调查提供一种快速、方便的病原学诊断手段,具有实用价值.     

实时荧光定量PCR技术进展

实时荧光定量PCR(real_time quantitative PCR)技术是一种新型的核酸定量检测、分析技术,它通过在PCR扩增反应过程中加入荧光物质,使得对反应过程的实时监控成为可能。它具有实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,已逐步成为分子生物学研究中的重要工具。