7株结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序分析

目的 :探讨结核分枝杆菌对乙胺丁醇 (EMB)产生耐药性的分子机制 ,建立直接快速检测结核分枝杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法 :采用PCR扩增技术对 7株耐乙胺丁醇结核分枝杆菌进行PCR扩增 ,扩增产物经纯化后 ,直接在ABI3 77型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果 :7株EMB耐药株的embB基因测序有 5株 ( 71.4% )发现点突变 ,其中Met(ATG)→Lle(ATA) 1例 ,Met(ATG)→Lle(ATC) 1例 ,Met(ATG)→Lle(ATT) 2例 ,Met(ATG)→Val(GTG) 1例 ,另外 2株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论 :embB3 0 6位氨基酸Met被置换是结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制 ,测序分析可确认耐药基因的突变位点 ,是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法     

46株结核分支杆菌初始耐药分析

目的 :了解 1 998年— 2 0 0 0年间我实验室培养阳性结核分支杆菌初始耐药性 ;方法 :采用绝对浓度的间接法进行 4种抗结核药物的耐药性测定 ;结果 :耐SM、INH、RFP、EMB率分别为 3 6.9%、2 6.1 %、2 3 .9%、2 1 .7% ;总耐药率为 58.7% ;耐 1药、2药、3药、4药的耐药率为 2 6.1 %、1 7.4%、1 3 .0 %、2 .2 % ;结论 :结核分支杆菌耐药情况严重 ,耐药率明显高于其他大中城市     

耐乙胺丁醇结核分枝杆菌基因型研究

目的研究青海地区耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株embB基因突变特征,并比较耐乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)菌株中耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug resistance,MDR)与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异。方法采用聚合酶链式反应方法对63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌的embB高突变区进行扩增,并分析embB基因突变特征。结果 63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌中,28株在embB基因发生突变,突变率为44.44%(28/63);53株结核分枝杆菌且耐乙胺丁醇菌株中,22株(45.51%,22/53)在embB基因发生突变;10株非结核分枝杆菌耐乙胺丁醇菌株中,6株(60.00%,6/10)在embB基因发生突变。位点embB306和embB406为高突变点,分别占突变菌株的67.86%(19/28)和21.43%(6/28)。耐乙胺丁醇菌株中,结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异无统计学意义(χ~2=0.536,P=20.464)。结论青海地区对乙胺丁醇耐药的结核分枝杆菌常见突变位点为embB306和embB406。单测embB基因不能非常有效地快速检测出乙胺丁醇耐药状况,增加emb A及其调控区的检测,能提高耐乙胺丁醇菌株的检出率。     

套式PCR及测序法检测痰中结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变

目的应用套式PCR及测序法直接检测痰中结核分枝杆菌相关的embB基因突变，以期建立一种直接、快速、准确地检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的实验方法。方法采用套式PCR扩增技术及测序法直接检测130例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌embB基因突变情况，同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养及菌型鉴定。结果29例耐乙胺丁醇标本有18例发生基因突变，均为306位密码子突变，基因突变率为62．1％（18／29）。结论套式PCR及测序法可望成为一种快速、特异、准确地检测痰中结核分枝杆菌embB基因突变的好方法。     

结核分支杆菌耐异烟肼基因inhA突变的测序研究

目的 :对多耐药株结核分支杆菌的inhA基因进行测序分析。方法 :inhA片段为引物 ,聚合酶链反应扩增产物 ,克隆后制备质粒 ,直接测定DNA序列。结果 :在17个耐异烟肼菌株中 ,11株出现inhA基因变异 ,突变率为64.7%。主要为碱基置换和缺失 ,各菌株变异不同。katG和inhA同时出现变异的比例高。结论 :结核菌的耐异烟肼 (INH)和乙胺丁醇 (EMB)变异与inhA突变有关 ,主要为点突变     

2327株结核分支杆菌耐多药情况分析

目的：了解当前结核病对一线及二线抗结核药物的耐药性及耐多药情况,为结核病防治提供依据。方法：采用WHO推荐的药敏测试法对2327株临床分离的结核分支杆菌进行药物敏感性试验。结果：总耐药率53.07%,耐多药率22.47%;近2年初始耐药占32.62%,获得性耐药占67.37%;并在102例耐多药结核病患者中发现9例严重耐多药结核病。结论：本地结核菌耐药率高于全国平均水平,耐药病例中初始耐药率较高,并已发现严重耐药结核病患者,建议积极开展耐药菌监测指导临床选择治疗方案。     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因检测研究

目的评价应用DNA序列分析方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用DNA序列分析法和PCR-SSCP法对80株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株32株,耐RFP或含耐RFP耐多药株48株)rpoB基因核心区域的突变情况进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,所有32株药物敏感株的rPOB基因均无突变.用DNA序列分析方法检测48株耐药株中44株发生突变,敏感性为91.7%(44/48),其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸.PCR-SSCP检测48株耐RFP分离株中,45株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为93.1%(45/48).结论DNA序列分析可指导临床用药,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性.     

应用寡核苷酸探针膜杂交方法快速检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型

目的应用寡核苷酸探针膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(isoniazid,INH)耐药性.方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH基因katG、inhA的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-direct sequencing,PCR-DS)结果比较.结果 20株INH敏感株中,仅9株出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→AAC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inha1探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变.36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示katG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inha1探针阳性杂交,25株与野生型探针inh1杂交阳性.katG基因膜杂交突变检出率为 50 %,inhA基因膜杂交突变检出率为 30.56 %.结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法.     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

结核分支杆菌的初始、获得性耐药及复治后MDR-TB研究

目的：了解本地近10年活动性结核病病人的初始、获得性耐药及复治后耐多药结核（MDR－TB）分布情况，为临床制定有效抗结核方案、防痨机构流行病学调查及制定宏观控制方案提供参考。方法：分临床及结核菌监测两部分。临床资料主要针对有流行病学意义的住院结核菌阳性病人，对不同地区及年龄段的结核菌阳性病人的治疗、预后、复治原因及死亡率作分析；耐药菌检测主要对门诊及住院病人的痰及其他标本作结核菌培养及NAP区分试验。结果：住院活动性结核病人9605例，结核菌阳性3282例，占34.16%，15－60岁年龄段占85％以上。复治结核菌阳性组合并症及药物毒副反应、死亡率均高于初治组；8984份标本作分支杆菌培养，阳性3697份（41.15%)；3373株结菌作耐药监测，总耐药率55.70%，初始耐药412株，占12.21%；初始MDR－TB菌154株，占初始耐药菌的37.37%。复治菌株耐药率43.49%，复治MDR－TB菌822株，占复治耐药菌的56.03%。结论：临床工作中，结核菌阳性病人占1／3左右，青壮年组占85％以上，复治及复治后组毒副反应及死亡率高。耐药率10年来有逐年增高趋势，初始耐药及获得性耐药率均高于全国平均水平，并趋于MDR－TB。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的研究

目的 :了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼 (INH)分离株katG基因突变情况 ,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。方法 :用PCR单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR直接测序法 (PCR DS)检测 30株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。结果 :以结核分枝杆菌H3 7RV 标准株对照观察所有INH敏感株的PCR SSCP和PCR DS图谱 ,均未发现异常 ;而在 12株INH耐药株中 ,有 4株无PCR SSCP和PCR DS图谱异常 ,占INH耐药株的33 4% ;有 5株在 94位发生核苷酸错义突变 ,占INH耐药株 41 7% ,有 3株在 96位发生核苷酸同义突变 ,占INH耐药株的 2 5 %。结论 :多数结核分枝杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致 ,可先用PCR SSCP筛选突变株 ,再用PCR DS方法测定其突变位点 ,达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的     

结核杆菌embB基因突变与临床治疗的关系

目的：了解结核菌耐乙胺丁醇药敏实验和embB基因突变情况，研究其临床应用价值。方法：通过聚合酶链反应(PCR)．单链构象多态性(SSCP)技术初步鉴定96株分支杆菌临床分离株的菌种，并进一步分析其embB基因。结果：分析56株分支杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分支杆菌标准株相同。21株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常；35株耐乙胺丁醇分离株中，17侏(48．6％)embB基因SSCP泳动异常。结论：部分结核分支杆菌耐乙胺丁醇是由于其embB基因突变所致。且embB基因突变均发生在药敏实验高浓度区。     

Detection and evaluation of the mutations of embB gene in ethambutol-susceptible and resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China

The situation of tuberculosis (TB) and Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) drug resistance is still very serious in China. Improper treatment for TB may lead to a prolonged course of antimicrobial therapy and spreading of drug resistant strains. Thus, rapid detection of drug resistant strains will allow prompt initiation and adjustment of effective chemotherapeutic treatment of TB. Ethambutol (EMB) is a first line anti-TB drug. embB Met306 is located in a cytoplasmic loop that forms an EMB resistance determining region,1 Lety et al2 have demonstrated that a missense mutation in the M. smegmatis embB gene confers EMB resistance. The identification of mutations in embB gene may offer a means to rapidly screen M. tuberculosis isolates for EMB resistance. Thus, in this study, we analysed 197 isolates of M. tuberculosis from Chinese people and characterized mutations in the 258 bp region of the embB gene.     

结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测

目的：探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系。方法：根据结核分枝杆菌genebank中katG序列，自行设计特异性寡聚核苷酸引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing，DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况．以H37，Rv标准株为对照。结果：所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常；35株耐药菌中，有2株(5．7％)katG基因扩增阴性，且发生在高度耐药菌中．进一步分析发现，SSCP法突变检出23株(65．7％)，测序法突变检出24株(68．6％)，符合率为95．8％(23／24)．结论：参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果，PCR-SSCP敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变，有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性方法的建立

目的:利用基因芯片技术检测结核分枝杆菌(MTB)对链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)耐药性的技术平台建立.方法:应用基因芯片法测定160株MTB临床分离株的SM和EMB耐药性,并与BAC了EC960法结果进行比较,分别对结果相符与不相符的菌株进行测序.结果:基因芯片法测定160株MTB临床分离株,结果显示SM敏感111株、耐药49株,以rpsL 43、88位aag突变为agg为主.芯片检测结果EMB敏感142株、耐药18株,耐EMB的MTB以embB 306位atg突变为gtg为主.基阅芯片法检测链霉素、乙胺丁醇耐药的敏感性、特异性分别为80.0%、99%和60.0%、100%.两种测定方法结果不符的菌株中,采用基因测序法测定,结果显示基因芯片法检测点突变具有高度的特异性.结论:基阅芯片法检测MTB对SM与EMB耐药性方法具有快速、简单,特异性高,准确性高,可作为MTB的SM与EMB耐药性快速筛选方法.     

结核分支杆菌依赖链霉素的实验观察

目的:调查临床结核菌分离株对链霉素的依赖状况。方法:采用双向匡氏琼脂培养基分离痰结核菌和作结核菌依赖性测定,采用匡氏琼脂培养基检测结核菌耐药性。结果:184例临床分离结核菌株链霉素的依赖情况:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且高浓度管菌落数≥低浓度管者占11.41%(21/184);含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且低浓度管菌落数>高浓度管者占2.72%(5/184);低浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而高浓度管菌落数<对照管者占4.35%(8/184);高浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而低浓度管菌落数<对照管者占4.35%(8/184)。总计,显示链霉素依赖特征的临床分离株占22.83%(42/184)。结论:约22.8%的结核菌临床分离株显示出链霉素依赖性,并具有不同的依赖特征。