稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系.方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段.用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1( ),构建真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:扩增出MCHR2的全长cDNA)成功构建pcDNA3.1( )MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株.结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础.     

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.     

前列腺癌上调表达基因BRP44的蛋白细胞定位及功能预测研究

目的 了解GFP-BRP44融合蛋白的细胞定位,初步预测BRP44的功能.方法 构建BRP44与GFP的融合表达真核载体,脂质体介导法转染高表达该基因的前列腺癌细胞株LNCaP,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位.生物信息学方法对基因BRP44进行序列分析及功能预测.结果 成功构建GFP-BRP44融合蛋白的真核表达载体,pEG-FP-BRP44融和蛋白在LNCaP细胞核及细胞质均有表达.与单纯GFP相比,融合蛋白在细胞质的表达相比细胞核更强.功能预测提示基因BRP44可能是一个受oct-1等转录因子调控,主要在细胞线粒体发挥基因调节作用的可溶性蛋白.结论 BRP44蛋白可能主要在细胞质发挥作用.     

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的：构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）/增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法：采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用Lipofectamine^TM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果：扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论：成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定

目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体（hCD123 CDS-pEGFP-N1）;经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为（97.94±1.93）%和（2.84±1.35）%,差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。     

Cx43在前列腺癌组织和PC-3细胞株中的表达及其意义

目的探讨缝隙连接蛋白43（Cx43）在前列腺肿瘤中的生物学意义。方法免疫组化法观察Cx43在正常组织和肿瘤组织以及体外培养的前列腺癌PC-3细胞株中的表达,并采用半定量RT-PCR法检测mRNA水平的变化。结果本实验在mRNA水平上证实PC-3细胞有Cx43 mRNA的表达,在蛋白水平上证实PC-3细胞和前列腺癌组织均有Cx43的表达,但其表达较正常者减弱,蛋白异常定位于胞浆中而非胞膜上。而且Cx43在前列腺癌组织中的表达与前列腺癌病理分级呈负相关。结论Cx43降低可能影响前列腺癌组织及前列腺癌细胞的发生和发展。     

表没食子儿茶素没食子酸脂对前列腺癌PC-3细胞体外生长的抑制作用

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)对人前列腺癌细胞体外生长的抑制作用,以及其对细胞增殖周期的影响。方法:用不同浓度的EGCG处理体外生长的前列腺癌PC-3细胞,通过对细胞形态的对比观察和MTT法检测EGCG对PC-3细胞的抑制作用,通过流式细胞术检测其对细胞周期的影响。结果:与对照组相比,EGCG处理组可使细胞明显变圆,体积增大,细胞内颗粒及脱壁细胞增多;MTT法显示,EGCG能明显抑制前列腺癌PC-3细胞生长,并呈时间、剂量依赖性(P<0.05);流式细胞术显示,EGCG处理的PC-3细胞被阻止在G0/G1期,并有凋亡峰出现。结论:EGCG通过阻滞细胞的增殖周期对前列腺癌PC-3细胞体外生长有明显的抑制作用。     

Inhibitory effect of a new gossypol derivative apogossypolone （ApoG2） on xenograft of human prostate cancer cell line PC-3

Objective： To investigate the inhibitory effect of apogossypolone （ApoG2） on prostate cancer cell line PC-3 in vivo, and explore its mechanism. Methods： The models of transplantation tumors in Balb/c nu/nu mice were established via subcutaneous injection of PC-3 cells and the tumor-transplanted mice were divided into 4 groups： control group and three ApoG2 treatment groups, with 10 mice in each group. Volumes of the tumor were estimated every 2 d and the morphology of tumor tissues was observed. Immunohistochemistry was employed to observe the expression of Bcl-2, PCNA, CD31, caspase-3 and caspase-8 in tumor tissues. Results： ApoG2 （2.5 mg/kg-10 mg/kg） given intraperitoneally once a day can obviously inhibit the growth of subcutaneous prostatic carcinoma implant. The tumor volume decreased obviously when the treatment dosage was bigger than 5.0 mg/kg （P〈0.01）. Meanwhile, ApoG2 decreased the expression of PCNA and CD31, and enhanced the expression of caspases-3, caspase-8 in tumor tissues. Conclusion： ApoG2 exert an inhibitory effect on prostatic carcinoma possibly by inducing apoptosis and inhibiting tumor angiogenesis.     

原花青素诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制研究

目的：探讨原花青素在体外诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制。方法：体外培养人前列腺癌PC-3细胞株,用100,200,300μg／ml原花青素作用24h。荧光素标记的连接素V（Annexin V—fluoresein isothiocyanate,Annexin V—FITC）和碘化吡啶（propidium iodide,PI）双染检测原花青素对PC-3细胞凋亡的影响,采用流式细胞术检测以不同浓度原花青素作用后PC-3细胞线粒体膜电位（△ψm）的变化。结果：100μg／ml原花青素作用细胞24h,5．64％的细胞出现早期凋亡,84．7％的P03细胞呈现线粒体膜电位降低;300vg／ml原花青素组P＆3细胞凋亡率和坏死率分别为44．86％、50．81％。结论：源花青素可在体外诱导PC-3细胞凋亡,其机制与降低线粒体膜电位有关。     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

人参胡核汤对人前列腺癌PC-3细胞周期的影响

目的：探讨人参胡核汤对人前列腺癌PC-3细胞周期的影响。方法：参照血清药理学方法,制备4组合药血清,即人参胡核汤高、中、低剂量及空白组。各组作用PC-3细胞48h、72h后,观察细胞形态学变化、细胞周期分布、凋亡率变化。结果：人参胡核汤各组含药血清作用48h、72h后,表现出不同程度的细胞皱缩,边缘毛糙,细胞核固缩或碎裂,细胞体积缩小;各组均可阻滞G1期向S期的转化;促进细胞不同程度的凋亡。结论：人参胡核汤含药血清可使PC-3细胞的形态发生改变、阻滞G1期向S期的转化、促进PC-3细胞凋亡。     

干扰CD44v3的表达对肺腺癌A549细胞侵袭行为的影响

目的研究肺腺癌细胞A549的侵袭能力和黏附分子CD44v3的关系。方法用pRNAT-H1.1/Neo(6.1 kb)质粒构建一个能够稳定转录短发卡RNA(shRNA)并干扰CD44v3分子表达的表达载体,将其转染A549细胞,用荧光免疫细胞化学法和Western blot检测A549细胞CD44v3表达的变化。用Boyden室和人工基底膜构建癌细胞的体外侵袭模型,计数并比较各实验组穿过人工基底膜的细胞数。结果肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,分子量为130 kD(1 kD=0.992 1 ku)。转染干扰质粒表达载体能够使A549细胞的CD44v3表达降低46%。癌细胞的离体侵袭模型中发现干扰组癌细胞侵袭能力为(4.00±1.22),空载对照组为(13.20±4.92),前者的癌细胞侵袭能力较后者下降70%(P<0.01)。抗CD44v3单克隆抗体(阳性对照组)也可降低A549细胞的侵袭能力,干扰组和阳性对照组比较,两者差异无显著性意义(P>0.05)。结论肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,用RNAi技术可降低其表达。CD44v3表达降低的A549细胞侵袭能力受到抑制。     

稳定表达饰胶蛋白聚糖基因的大鼠肾小球系膜细胞株的建立

目的 研究将饰胶蛋白聚糖（decorin,DCN）基因转染大鼠肾小球系膜细胞的可行性。方法 RT-PCR法扩增大鼠DCN基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1A-DCN,采用脂质体将其转入大鼠MsC,经G418筛选阳性克隆,Western blot及RT-PCR法鉴定。结果 成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1A-DCN,转染MsC并筛选出2个阳性克隆株。结论 构建载有DCN基因的MsC载体,为其开展对肾小球疾病模型的基因治疗提供了良好的实验基础。