肝富集转录因子对乙型肝炎病毒转录与复制的调控

乙肝病毒具有明显的嗜肝性.在非肝源乙肝病毒复制体系中,发现肝富集转录因子在HBV肝特异性复制过程中起重要作用.其中.肝富集转录因子HNF4和RXRα-PPARα是调节前基因组RNA转录和病毒复制所必需,是病毒嗜肝性的重要决定因素之一,而肝富集转录因子HNF3对HNF4和RXRα-PPARα介导的HBV转录和复制具有抑制作用.从而揭示HBV的嗜肝机制涉及HBV感染进入细胞和HBV基因转录复制两个水平的调控.     

肝细胞核因子3结合位点的突变及对抑制乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究肝细胞核因子(HNF)3结合位点HNF3β对HBV转录和复制调节作用的机制.方法 通过分别位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和sp区上的HNF3结合位点,构建HBV基因组2个或3个位点的复合突变,获得4个复合突变型重组质粒;分别转染非肝源性细胞小鼠成纤维细胞株(NIH3T3),Northern印迹法检测3.5 kb、2.4 kb/2.1 kb、0.7 kb HBV RNA的转录水平,Southern印迹法检测HBV DNA复制中间体水平,观察上述突变是否会影响HNF3β对HBV转录和复制的抑制作用.结果 在被转染的非肝源性细胞3T3中,HNF3β仍能降低4个复合突变型HBV重组质粒3.5 kb HBV RNA的转录水平,抑制HBV DNA的复制;与未共转染HNF3β相比,转录水平下降50%～75%、复制水平下降80%～96%.结论 在位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和Sp区上的3个HNF3结合位点中,即使其中2个或3个结合位点同时联合突变,HNF3β仍能抑制HBV的转录和复制.Pp、PS1p和Sp区HNF3结合位点的突变不能阻断HNF3β对HBV复制的抑制作用.     

乙型肝炎病毒基因组C区启动子肝富集转录因子结合位点突变对HBx增强乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建乙型肝炎病毒（HBV）C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组HBV复制型质粒,以期阐明其在HBx增强HBV复制中的作用。方法:利用定点突变技术在野生型HBV复制型质粒和HBx表达缺失的HBV复制型质粒基础上构建HBV C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组质粒。随后在HBV肝癌细胞复制模型和小鼠复...     

肝细胞核因子4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型建立及初步应用

目的建立一种肝细胞核因子4α(HNF4α)增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型。方法从临床获得的急性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV全长DNA;手术获得肝组织中提取总RNA,扩增并克隆HNF4α基因cDNA。BspQI/ScaI双酶切回收HBV全长DNA,HNF4α基因cDNA定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-4α表达载体。将HBV全长DNA1μg/孔,按比例共转染pcDNA3.1-4α(0,0.5μg,1μg)于HepG2细胞,96 h后检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA;以0.5μg/1μg pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA共转染HepG2细胞,加入不同浓度LAM(0,100μmol/L)和ETV(0,10μmol/L),评价建立的体外复制模型。结果 1%TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV全长DNA和HNF4αcDNA PCR产物,条带长度为3.2 kb和1.5 kb;目的片段克隆后测序鉴定正确。胶回收HBV全长DNA克隆质粒酶切目的片段,构建的pcDNA3.1-4α表达载体酶切鉴定正确后,测序鉴定。不同浓度比例的pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA转染HepG2细胞后,0μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBsAg阴性,上清HBV DNA载量为103;0.5μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到1.99,上清HBV DNA载量从1×10~3 IU/mL升高到4×10~4 IU/mL;1μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到2.4,上清HBV DNA载量从1×10~3 IU/mL升高到1×10~5 IU/mL;LAM从0~100μmol/L,细胞上清HBV DNA降低了97.6%;ETV从0~10μmol/L,上清HBV DNA降低了99.0%。结论 HNF4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型,可以体外评价临床常用抗病毒药物,为后续HBV研究提供新思路。     

载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G抑制乙型肝炎病毒和鸭乙型肝炎病毒复制

目的了解载脂蛋白质BmRNA编辑酶催化多肽3G（APOBEC3G）对乙型肝炎病毒（HBV）和鸭乙型肝炎炎病毒（DHBV）复制的抑制作用。方法从健康人外周血单个核细胞提取RNA，逆转录聚合酶链反应扩增APOBEC3G，将产物克隆到pXF3H载体的EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点以构建真核表达质粒；以ayw亚型HBV全长质粒构建具有复制能力的1．3倍HBV质粒（pHBV1．3）。不同剂量的APOBEC3G真核表达质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞；酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液的乙型肝炎表面抗原和e抗原水平，Southernblot和Northernblot分析HBV核衣壳相关DNA和RNA的水平变化。不同剂量APOBEC3G真核表达质粒与头尾相接的2倍DHBV质粒共转染LMH鸡肝癌细胞，Southernblot分析DHBV核衣壳相关DNA水平变化。结果成功构建APOBEC3G真核表达质粒和具有复制能力的1．3倍HBV质粒。APOBEC3G抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌，转染细胞内HBV核衣壳相关RNA表达水平下降，而对核心蛋白质的表达没有影响；APOBEC3G对转染细胞内HBV和DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应。结论APOBEC3G对HBV和DHBV复制具有抑制作用。     

RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响

目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1%vs 100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平最低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

HNF4α与肝细胞分化调节

肝脏基因表达受肝富集转录因子(LETFs)的调控,这类肝脏内优势表达的转录因子在调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能发挥重要作用[1].肝细胞核因子(HNF)是LETFS的重要组成,HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、D结合蛋白(DBP),对肝脏基因特异性表达起着关键的调控作用.HNF4是一种细胞核激素受体超家族的转录因子[2],包括3个亚型:HNF4α,-4β,-4γ,其组织表达谱差异较大.HNF4α和HNF4γ具有70％同源性,DNA结合区的氨基酸序列非常类似.     

肝细胞因子3和乙型肝炎的调节关系

0 引言乙肝病毒(HBV)是很小的包膜病毒,基因组结构精密,仅约3200个碱基(bp),但能以最小容量发挥高效功能.HBV DNA 复制周期开始于共价闭合环状 DNA(cccDNA),先转录为前基因组 RNA,然后反转录为负链DNA,再合成正链 DNA,双链 DNA 又成熟为 cccDNA,是一个连续的过程.分散在整个 HBV 基因组中有多个调节元件,与细胞或病毒产生的调节因子结合,增强或抑制不同基因的表达.肝细胞因子3(HNF3)是重要的转录调节因子,对于调节前基因组 RNA 和前核心 RNA 等的转录复制有重要的作用.     

针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

替比夫定(素比伏)体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的观察替比夫定体外对乙型肝炎病毒（HBV）复制的抑制作用。方法HBV复制子pHBV1．3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。用ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg水平,用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测培养上清中HBVDNA拷贝数,用Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替比夫定在体外对HBV有较强的抑制作用。     

HBV T1719G mutation reduced HBV replication through mutant Enh II and HBx protein in vitro

It was repeatedly reported that the hepatitis B virus (HBV) T1719G mutation was very common and related to progression and malignancy of liver disease. However, its effect on viral replication efficiency remains unclear. In this study, we aimed to evaluate the function and mechanisms of the T1719G mutation on viral replication capacity. Wild‐type and T1719G mutation‐bearing HBV1.2× plasmids were transfected into Huh7 and HepG2 cells, respectively, and HBV total RNA, 3.5 kb RNA and supernatant HBV DNA were assessed using real‐time PCR, hepatitis B surface antigen (HBsAg) and hepatitis B e antigen (HBeAg) levels were measured by time‐resolved fluoroimmunoassay. In order to assess Enh II activity and the binding capacity of HNF3β to Enh II sequence, dual‐luciferase assay and Chromatin immunoprecipitation (ChIP)‐PCR were employed, respectively. Simultaneously, the HBx or HBx‐mut (T1719G) plasmid was co‐transfected to evaluate the effect of HBx on viral replication. Our results showed that the T1719G mutation impaired viral replication efficacy compared with the wild type both by reducing Enh II activity and binding capacity of HNF3β with Enh II. And such reduction caused by T1719G mutation could be rescued by HBx protein. Our results show that the T1719G mutation decreases HBV viral replication capacity possibly by mutant HBx protein and altered Enh II activity.     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。     

乙型肝炎病毒(HBV)反基因与HBV的结合及对HBV复制的影响

目的 研究三螺旋形成寡核苷酸与HBV基因的结合情况及其对HBV复制的影响。方法 全盛一段能与HBV核心启动子位点（1734-1753nt)形成三螺旋的寡核苷酸（TF020）并标记上生物素分别用脂质体-TF020及裸TF020转染HepG2.2.15细胞,用链酶亲和素-生物素法（SABC）检测其转染效率及其与HepG2.2.15细胞中HBVDNA的结合情况;并采用ELISA、半定量逆转录（RT）-PCR及荧光定量PCR法分别检测经寡核苷酸处理的HepG2.2.15细胞及空白对照细胞上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA及细胞中HBV RNA的水平。结果 脂质体-TF020转染HepG2.2.15细胞的效率可达80%,而裸TFO20转染率最高为40%;TF020主要定位于细胞核及胞浆中,TF020处理组细胞上清中HBsAg、HBeAg含量分别较空白对照组降低37.0%及78.2%,HBV DNA水平较空白对照组明显降低;而细胞中2.4kb/2.1kb RNA、3.5kb/3.4kbRNA亦分别降低31.6%及70.2Z%。结论 TF020通过脂质体包裹后可以很好地进入细胞并与HBV DNA结合;TF020能够有效地抑制HBV复制,发挥抗病毒作用。