门静脉输注供体脾细胞诱导基因大鼠心脏移植耐受

目的通过门静脉输注同种异基因脾细胞、腹腔给予环磷酰胺诱导同种心脏移植耐受 ,并探讨其耐受机理。方法经门静脉给予受体大鼠 3× 10 8个异基因供体脾细胞 ,2 d后腹腔注射 80 m g/kg的环磷酰胺 ,10 d后实施心脏移植手术。观察、记录移植物的存活时间 ,通过 ML R、DTH、IL- 2逆转实验及过继性转移实验 ,探讨耐受机理。结果异基因心脏移植物的存活时间明显延长 ;ML R和 DTH实验证明 :受体大鼠的免疫应答受抑制 ,且该耐受表现为供体特异性 ;IL- 2逆转实验、过继性转移实验表明 :该耐受与克隆失活、抑制细胞和“感染”耐受机理有关。结论本诱导方案对于大鼠心脏移植存活时间的延长是一有效的方法 ,移植耐受的形成涉及多种机制。     

联体共生诱导异基因大鼠心脏移植耐受

目的通过异基因大鼠联体共生诱导心脏移植耐受并探讨其耐受机理.方法将DA和LEW的脾细胞(2×108)分别经舌静脉注射给对方,2d后均经腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg),第3天实施联体手术,联体1w后分开,在DA→LEW之间进行异位心脏移植手术.观察、记录移植物的存活时间,通过胸腺和脾脏内嵌合体检测、MLR、体内细胞转移、IL-2逆转实验,探讨耐受机理.结果异基因心脏移植物的存活时间明显延长;嵌合体检测显示耐受的形成和嵌合体的存在成相关性,MLR和体内细胞转移实验证明,受体大鼠的免疫应答受抑制表现为供体特异性,并且受体存在抑制细胞;IL-2逆转实验表明该耐受与克隆失活(anergy)有关.结论通过联体共生诱导大鼠耐受、延长心脏移植存活,移植耐受的形成涉及多种机制.     

CTLA-4 Ig腺病毒基因治疗联合供体细胞输注诱导混合嵌合体和大鼠心脏移植耐受

目的　在心脏移植手术中实施CTLA 4Ig腺病毒基因治疗并联合术后输注供体骨髓细胞 ,诱导异基因大鼠心脏移植耐受 ,并对相关机制进行研究。方法　将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠 ,同时经门静脉输注供体DA的脾细胞 (SC ,3× 10 8)、CTLA 4Ig腺病毒 [( 1～ 5 )× 10 9PFU ml],第 4天由舌静脉输注DA的骨髓细胞 (BMC ,3× 10 8)。观察、记录心脏移植物的存活时间。并对皮肤移植的受体作同样处理 ,观察皮肤移植存活情况。通过MLR、IL 2逆转实验及嵌合体的测定 ,探讨耐受机理 ,并检测了CTLA 4Ig的体内表达、TH1 TH2型细胞因子的表达。结果　单用CTLA 4Ig腺病毒基因治疗 ,或CTLA 4Ig腺病毒基因治疗联合单独的供体脾细胞或骨髓细胞能不同程度地延长异基因心脏移植物的存活 ,但不能延长皮肤移植物的存活。脾细胞、CTLA 4Ig腺病毒和骨髓细胞(SC Ad BMC)处理组的心脏移植物存活时间明显超过其它各耐受诱导组 ,并且能够诱导皮肤耐受。RT PCR实验证明 ,在受体内不同的组织CTLA 4Ig基因的表达量有所不同 ,并且随着时间的推移表达下降。TH1和TH2型细胞因子的检测显示 ,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子的偏移现象。MLR证明耐受大鼠的免疫应答表现为供体特异性降低 ,IL 2逆转实验、嵌合体检测表明 ,该耐受可能与     

腺病毒介导的CD40Ig基因治疗诱导异基因大鼠心脏移植物的长期存活

目的:通过腺病毒介导的CD40Ig基因治疗,阻断受体体内CD40/CD154共刺激途径,诱导异基因大鼠之间的心脏移植耐受,并探讨相关机制。在将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠后,即经门静脉输注携带CD40Ig基因的腺病毒(AdCD40Ig,5×109 pfu)。观察、记录心脏移植物的存活时间。ELISA检测受体大鼠体内CD40Ig蛋白的表达。通过MLR,IL-2逆转实验及Th1/Th2型细胞因子表达的检测,研究耐受的机制。结果:与未处理对照组相比,携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(AdEGFP)给予组,移植物的存活时间未见明显延长;AdCD40Ig腺病毒给予组,异基因大鼠心脏移植物平均存活时间延长至(142.8±26.8)天。ELISA检测表明,CD40Ig蛋白在受体体内表达时间较长,但随时间的推移表达水平逐渐下降。Th1和Th2型细胞因子的检测结果显示,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子偏移的现象。MLR证明耐受大鼠对供体抗原表现为特异性低应答。IL-2逆转实验表明,该耐受形成的早期与克隆无能有关。结论:经.AdCD40Ig腺病毒基因治疗的受体大鼠可以产生特异性的移植耐受,使异基因大鼠心脏移植物长期存活。     

供体脾脏中的T细胞在移植耐受诱导中的作用

目的：探讨供体脾脏中的T细胞在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中的作用。方法：在“细胞后环磷酰胺”方法的基础上输注供体脾细胞或去除T细胞的供体脾细胞,然后进行皮肤移植。观察皮肤存活情况并探讨耐受形成机制。结果：脾细胞输注后供体皮肤存活明显延长,而去除T细胞后皮肤存活不能被延长。克隆不应答、抑制细胞和嵌合体的形成等机制都参与了耐受形成。结论：供体脾脏中的T细胞在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中具有重要作用,它可能和宿主中克隆不应答的发生、抑制细胞的产生或活化及嵌合体的维持有关。     

诱导HO-1表达延长大鼠心脏移植物存活时间

目的了解血红素加氧酶-1(HO-1)在延长异基因大鼠心脏移植物存活中的作用及其机制。方法雄性LEW(RT11)和LEW.1W(RT1u)大鼠分别作为供体和受体,受体鼠分别应用CoPPIX 5 mg/(kg.d),SnPPIX5 mg/(kg.d)。对照组及实验组均6只鼠。由移植手术前1日开始至发生排斥,比较心脏移植物存活时间,分别在移植后第5天取心脏进行HE染色及CD3、CD25、ED1和K i-67染色;并测定HO-1活性和用W estern b lot定量HO-1蛋白;进行受体脾细胞接受供体脾细胞刺激的混合淋巴细胞培养。结果对照组心脏移植物平均7 d出现排斥;应用CoPPIX诱导HO-1表达后存活时间为13.5 d,显著长于对照组(P<0.05)。而应用SnPPIX治疗后存活时间为6.5 d。对照组与SnPPIX治疗组的心脏移植物中有中等量的细胞浸润,CoPPIX治疗组移植物组织中的CD3 T细胞、CD25 细胞、巨噬细胞和增殖细胞都明显少于SnPPIX及对照组。同对照组相比,CoPPIX诱导HO-1表达明显抑制体内脾细胞增生(P<0.05),而SnPPIX无抑制。结论诱导HO-1表达能够抑制大鼠淋巴细胞的免疫活性并延长异基因心脏移植物的存活。     

抗TCRαβ单抗联合供体骨髓细胞输注诱导小鼠皮肤移植耐受的研究

探讨抗TCRαβ单克隆抗体联合大剂量供体骨髓细胞输注方法对同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导的促进作用。第 0天 ,C5 7BL/ 6 (H 2 b,B6 )小鼠尾静脉注入 2× 10 8BALB/c (H 2 d,B/c )来源的骨髓细胞 ,同时腹腔注射抗TCRαβ单克隆抗体5 0 0 μg ;第 6天进行皮肤移植 ;在不同的时间对B6小鼠进行迟发型超敏反应 (DTH )、混合淋巴细胞反应 (MLR )等耐受状态进行检测 ,并进行MLR的IL 2逆转实验、过继转移实验和嵌合状态分析以初步探讨耐受形成机制。结果显示 ,经抗TCRαβ单克隆抗体联合大剂量供体骨髓细胞输注处理的B6小鼠的供体皮肤移植物平均存活 5 0 4d ,显著长于其他各组 (P <0 0 0 1)。相对于正常对照组小鼠 ,耐受B6小鼠在DTH和MLR中均表现出显著的低反应性 (P <0 0 0 1)。IL 2逆转实验结果表明克隆无能参与了移植耐受的形成。体内、外过继转移实验均显示耐受B6小鼠脾细胞中存在抑制细胞活性。嵌合体检查结果表明在耐受B6小鼠的胸腺和脾脏中均形成了混合嵌合体 ,在皮肤移植后第 15、 30和 70天时脾脏内供体来源嵌合体水平依次为 15 86 % ,10 5 7%和 1 77% ,胸腺中依次为 8 19% ,5 72 %和 1 87% ,嵌合体水平随时间而下降。这些表明 ,抗TCRαβ单抗联合大剂量供体骨髓细胞输注可以在异基因成年小?     

诱导HO-1表达延长大鼠心脏移植存活时间

目的 了解血红素加氧酶-1（HO-1）在延长异基因大鼠心脏移植物存活中的作用及其机制。 方法 雄性LEW (RT1l)和LEW.1W(RT1u)大鼠分别作为供体和受体，受体鼠分别应用CoPPIX (5mg·kg-1·day-1), SnPPIX (5mg·kg-1·day-1)对照组及实验组，各组均6只鼠。由移植手术前1日开始至发生排斥，比较心脏移植物存活时间，分别在移植后第5天取心脏进行HE染色及CD3、CD25、ED1和Ki-67染色；并测定HO-1活性和用Western blot定量HO-1蛋白；进行受体脾细胞接受供体脾细胞刺激的混合淋巴细胞培养。结果 对照组心脏移植物平均7d出现排斥；应用CoPPIX诱导HO-1表达后存活时间为13.5d，显著长于对照组(p<0.05)。而应用SnPPIX治疗后存活时间为6.5d。对照组与SnPPIX治疗组的心脏移植物中有中等量的细胞浸润，CoPPIX治疗组移植物组织中的CD3+T细胞、CD25+细胞、巨噬细胞和增殖细胞都明显少于SnPPIX及对照组。同对照组相比，CoPPIX诱导HO-1表达明显抑制体内脾细胞增生(p<0.05)，而SnPPIX无抑制。结论 诱导HO-1表达能够抑制大鼠淋巴细胞的免疫活性并延长异基因心脏移植物的存活。     

供体骨髓细胞输注促进小鼠皮肤移植耐受及其机理的研究

目的　探索“细胞 +环磷酰胺 (cyclophosphamide ,CP)”系统联合抗H 2 b 单克隆抗体、供体骨髓细胞输注诱导移植耐受的作用及其机制。方法　第 0天 ,经尾静脉给C5 7BL/ 6 (H 2 b,B6 )小鼠注入 10 8BALB/c(H 2 d,B/c)来源的脾细胞 ,第 2天 ,腹腔注射环磷酰胺 2 0 0mg/kg ,第 3、5天 ,分别经尾静脉注入抗H 2 b 单抗 ,剂量为 40 0 μg/ 0 .5ml,第 8天进行皮肤移植。皮肤移植后 1周 (第 15天 ) ,输入 2× 10 7供体BALB/c来源的骨髓细胞。观察皮肤移植物存活时间 ,并于第 30天对耐受B6小鼠作混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR) ,迟发型超敏反应 (delayedtypehypersensitivity ,DTH)等确定耐受的状态。并通过过继转移实验、嵌合体检查及脾细胞中细胞因子mRNA的表达情况 ,进一步探讨耐受形成的机制。结果　采用此诱导方案 ,B6小鼠对BALB/c小鼠的皮肤移植物长期存活。耐受可以被过继转移 ;耐受小鼠胸腺内的嵌合程度与耐受的维持密切相关 ;TH1型细胞因子在耐受小鼠中明显降低 ,而TH2型细胞因子明显升高。结论　“细胞 +CP”系统联合H 2 b 单克隆抗体、供体骨髓细胞输注能够诱导异基因小鼠皮肤移植耐受。耐受机制与胸腺嵌合体的存在密切相关。克隆无能 (aner gy)、抑制细胞和TH1/TH2偏移在耐受中也     

未成熟树突状细胞诱导建立异基因嵌合体及延长移植物存活的可能机制

目的：研究应用供体来源的未成熟树突状细胞(inDCs)注射受体小鼠后，诱导形成异基因嵌合体及延长移植物存活的机制。方法：(1)应用供体(C57BL／6)来源的骨髓细胞，在体外培养出imDCs，灭活后体内输注或体外直接刺激受体小鼠(Balb/C)的脾细胞，观察脾细胞对供体细胞的应答反应；(2)取已建立异基因嵌合体并有效延长移植物存活的受体小鼠的脾细胞，观察其对供体细胞刺激的应答反应；(3)通过半定量RT—PCR检测不同免疫状态下Th1／Th2型细胞因子的表达情况。结果：应用imDCs体外预刺激脾细胞或体内注射imDCs受鼠的脾细胞，均呈现对供鼠脾细胞刺激的特异性低应答，这种低应答主要出现在受鼠脾细胞在供鼠脾细胞刺激后的72小时内；建立异基因嵌合体并延长移植物存活的受鼠对来自供鼠脾细胞的刺激也表现为低应答，而对于无关第三者脾细胞的刺激仍保持较高水平，二者比较，统计学处理有显著性差异(P＜0．05)；在诱导形成异基因嵌合体及延长移植物存活的过程中，一定程度上显示出Th1／Th2模式的偏移。结论：应用供体来源的imDCs注射给受体，诱导形成异基因嵌合体和延长移植物存活的机制可能与imDCs诱导受体T细胞无能有关，而且此过程中在一定程度上表现为Th1向Th2方向的免疫偏移。     

Simultaneous administration of a low-dose mixture of donor bone marrow cells and splenocytes plus adenovirus containing the CTLA4Ig gene result in stable mixed chimerism and long-term survival of cardiac allograft in rats

T-cell costimulatory blockade combined with donor bone marrow transfusion may induce mixed chimerism, rendering robust tolerance in transplanted organs and cells. However, most protocols entail high doses of donor bone marrow cells (BMCs) or repeated administration of costly agents that block costimulatory pathways, thus delaying clinical development. To circumvent these shortcomings, we developed a strategy in which the dosage of donor BMCs was reduced but compensated by donor splenocytes (SPLCs). Furthermore, repeated administration of costly agents was replaced with a single injection of adenovirus expressing a gene of interest. In rat cardiac transplantation models, cardiac allografts from DA (RT-1a) rats were transplanted heterotopically into the abdomen of LEW (RT-11) recipient rats. Immediately after cardiac transplantation, an adenovirus vector (AdCTLA4Ig; 5 x 10(9) plaque-forming units) containing the gene for CTLA4Ig was administered to recipients (n = 6) simultaneously with a low dose of donor BMCs (1 x 10(8)/rat) and SPLCs (5 x 10(7)/rat) via the portal vein. The treated LEW recipient rats developed long-lasting mixed chimerism (>10% at >100 days) and exhibited long-term cardiac allografts (mean survival time of > 200 days) compared with control recipients. Moreover, recipients displaying long-lasting mixed chimerism accepted subsequent donor skin allografts while promptly rejecting third-party skin allografts. These results suggest that blockade of the CD28-B7 pathway, using adenovirus-mediated CTLA4Ig gene transfer, in concert with a low dosage of donor BMCs and SPLCs, may represent a feasible strategy to induce stable mixed chimerism and permit long-term survival of cardiac allografts.     

间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受

背景：胰岛移植为有望根治糖尿病的一种方法,而移植排斥问题阻碍了移植的开展,诱导受体对供体移植物的免疫耐受是解决同种异体移植排斥反应的关键。 目的：观察骨髓间充质干细胞输注对糖尿病小型猪同种异体胰岛移植物存活时间的影响。 方法：无菌条件下抽取动物骨髓,离心弃上清。取单核细胞层,洗涤后加入L-DMEM培养基,调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。培养48 h后换液去除未贴壁的细胞,依据贴壁培养法分离和扩增间充质干细胞。取第5代细胞作为移植供源,调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1。四氧嘧啶制备糖尿病小型猪模型,随机分为骨髓细胞组和干细胞+骨髓细胞组,经肝门静脉分别植入胰岛细胞、骨髓细胞,胰岛细胞、骨髓细胞和骨髓间充质干细胞。 结果与结论：骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注较单纯骨髓细胞输注能显著延长同种异体小型猪胰岛移植物存活时间(P < 0.05),同时受体血清胰岛素能较长时间维持较高水平。提示骨髓间充质干细胞输注能显著延长猪胰岛移植物存活时间,并促进胰岛移植物正常功能的发挥。     

负向调节树突状细胞对心脏移植大鼠调节性T细胞的影响

目的:探讨受者树突状细胞(DC)与体外光化学法(PUVA)处理的供者脾淋巴细胞共培养,对心脏移植受者CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)及移植心存活时间的影响。方法:以DA大鼠为供者,Lewis大鼠为受者,SD大鼠为无关供者,建立大鼠腹部异位心脏移植模型。分离正常的供者脾淋巴细胞(SP),制备经PUVA处理的供者脾淋巴细胞(PU-VA-SP)。在体外将DA大鼠PUVA-SP或SP与受者骨髓来源的DC共同培养,收集经上述处理后受者DC,流式细胞术(FCM)检测其表面分子CD80、CD86以及OX6的表达状况。根据受者术前静脉输注的成分将实验动物随机分为3组:①Control组:单纯输注PBS,n=7;②SPDC组:输注加载供者SP的受者大鼠DC,n=8;③PUVA-SPDC组:输注加载PUVA处理的供者SP的受者大鼠DC,n=8。移植术前7d,经外周静脉给受者输注与PUVA-SP共培养后的DC(PUVA-SPDC组)、正常受者DC(DC组)或只输注PBS(Control组),移植术后观察受者移植物的存活时间,检测受者外周血中CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25highT细胞的比例及其Foxp3表达状况。过继转移PUVA-SPDC组受者大鼠的T细胞后,检测正常LEW大鼠对供者抗原或无关抗原的DTH反应。结果:受者DC与供者未经处理的脾淋巴细胞(SP)混合培养后,其表面分子CD80、CD86以及OX6的表达分别为16.6%±0.72%、36.5%±0.87%及65.6%±1.45%,明显高于未处理DC组(3.53%±0.27%、13.0%±0.57%及27.7%±1.23%)(P0.01);而受者DC与PUVA处理过的供者脾淋巴细胞(PUVA-SP)混合培养后,其表面分子的表达仍保持较低的水平,CD80、CD86以及OX6的表达分别为3.9%±0.12%、13.4%±0.59%及28.0%±1.73%,与未经任何处理的受者DC无统计学差异(P0.05)。移植术后,PUVA-SPDC组受者,外周血CD4+CD25+T、CD4+CD25highT细胞占CD4+T的比例分别是18.97%和3.81%,明显高于输注DC组(4.40%和0.81%)和Control组(3.11%和0.09%)的大鼠(P0.01)。PUVA-SPDC组大鼠外周血CD4+CD25+T细胞中Foxp3表达率为29%±1.73%,CD4+CD25highT细胞中Foxp3阳性率高达95%±1.67%,均明显高于对照组(12%±0.58%和19.3%±2.03%)及DC(16.3%±0.88%和52.0%±1.73%)组(P0.01)。PUVA-SPDC组大鼠移植心存活时间为(27.3±0.98)d,与Control组(6.7±0.29)d及DC组(11.0±0.32)d相比,明显延长(P0.01)。过继转移实验显示,接受PUVA-SPDC组受者T细胞的正常LEW大鼠对DA大鼠抗原的刺激呈特异性免疫低应答状态。结论:PUVA-SPDC能够在移植受者体内诱生CD4+CD25+Foxp3+Treg,同时诱导抗原特异性免疫低反应,进而延长异基因移植物的存活时间。     

髓腔内骨髓移植诱导异基因小鼠皮肤移植耐受的研究

探讨髓腔内骨髓移植(IBM-BMT)对异基因小鼠皮肤移植耐受的诱导效果。受鼠为雌性C57BL/6(H-2b,B6)小鼠,于第0天接受60Coγ射线全身照射(TBI),4 h内输注雄性BALB/c(H-2d)小鼠来源的骨髓细胞(BMC),2 d后腹腔注射环磷酰胺(CTX)。通过皮肤移植、混合淋巴细胞反应(MLR)检测耐受状态,并通过骨髓染色体分析了解BMC的植入程度。结果显示,接受IBM-BMT的B6小鼠对BALB/c小鼠的皮肤移植物平均存活时间(MST)超过300 d,显著长于其余两组(P<0.001);MLR结果证明,实验组B6小鼠获得供体特异性耐受,在耐受小鼠骨髓中可检测到一定比例的Y染色体存在。以上表明髓腔内骨髓移植可以保证异基因骨髓细胞的植入并形成混合嵌合状态,从而有效地诱导免疫耐受。     

Cardiac allograft acceptance after localized bone marrow transplantation by isolated limb perfusion in nonmyeloablated recipients

Donor-specific tolerance to cardiac grafts may be induced by hematopoietic chimerism. This study evaluates the potential of localized bone marrow transplantation (BMT) performed by isolated limb (IL) perfusion to induce tolerance to secondary cardiac grafts without myeloablative conditioning. BALB/c recipients (H2d) preconditioned with lethal and sublethal doses of busulfan were injected i.v. and IL with 10(7) whole bone marrow cells (wBMCs) from B10 donors (H2(b)). Two hours after IL infusion of PKH-labeled wBMCs into myeloablated hosts, there were few labeled cells in the host peripheral blood (p < 0.001 versus i.v.) and femurs of the infused limb contained 57% +/- 7% PKH-labeled blasts (p < 0.001 versus 8% +/- 0.6% after i.v.). Femurs of the noninfused limbs contained 60-70 PKH-labeled blasts (p < 0.001 versus i.v.-BMT) after 2 days and 47% +/- 5% of 0.32 x 10(7) donor cells (p < 0.001 versus 78% +/- 4% of 1.2 x 10(7) donor cells in infused femurs) after 4 weeks. The survival rates of myeloablated hosts were 90% and 80% after i.v. and IL infusion, respectively, and the chimeras had 78%-84% donor peripheral blood cells. In recipients conditioned with 35 mg/g busulfan, the levels of donor chimerism in peripheral blood were 33% +/- 4% and 21% +/- 4% at 3 weeks after i.v.- and IL-BMT, respectively. Transplantation of donor-matched (H2(b)) secondary vascularized hearts in these chimeras after 3 weeks resulted in graft survival for periods exceeding 8 weeks, while third-party (H2(k)) allografts were acutely rejected (p < 0.001 versus H2(b)). These data indicate that IL perfusion is a reliable alternative procedure for establishment of hematopoietic chimerism and donor-specific tolerance without myeloablative conditioning.     

供体脾细胞输注诱导小鼠移植耐受及其机理的研究

目的以持续供体脾细胞输注的方法建立异基因嵌合体动物模型,并探讨移植耐受形成的机制。方法BALB/c（H-2